hsamir125a3p和hsamir125a5p对非小细胞肺癌侵袭转移的作用研究.pdf

中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任 论文作者签名：垒丝整 日期： 为I 口、上．1 7 ．、 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究 生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学本人保 证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科 大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学学 校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密 内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文 论文作者签名：圣塑鏊 指导教师签名：辎 日 ；“引副H?"，ij，j ，!．：=I“， 甍， 、。

、，， 0 ．矽 目录 ＼IlYlllllllll76ll／lllllltltl／lll9ltlll螋 一、摘要 中文论著摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 英文论著摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9 二、英文缩略语⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 0 三、论文 论文一 前+ 言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 1日U 舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯Z l 材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 2 实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 4 讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 0 结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 1 论文二 前一言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 2日O 舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 Z 材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 3 实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 5 讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 4 结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 6 四、本研究创新性的自我评价⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 7 五、参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 8 六、附录 综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5 2 在学期间科研成绩⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6 6 致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6 7 个人简介⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6 8 中文论著摘要 M i c r o R N A H s a - m i R 一1 2 5 a 一3 p 和H s a - m i R 一1 2 5 a 一5 p 对 非小细胞肺癌侵袭转移的作用研究 刖昌 M i c r o R N A ( m i R N A ) 是近年来备受关注的一类普遍存在于动、植物中的非编码 小R N A ，大约2 0 ．2 4 个核苷酸，来自于长的转录子前体砸．m i R N A 和p r e ．m i R N A 。

M i R N A 与其靶m R N A 分子的3 ’端非编码区( 3 - U T R ) 不完全互补结合，在多细 胞生物体中，转录后调控基因的表达，影响着几乎所有的信号通路，参与多种生 理病理过程，在肿瘤的发生和发展中也发挥了重要的调节作用 目前研究最为清楚的R a s 相关单体G T P 酶家族为R h o ，R a c l 和C D C 4 2 ，它们参 与细胞内多样的调节作用，包括细胞骨架的重构，细胞的迁移和侵袭R h o 相关 的丝／苏蛋白激酶( R h o - a s s o c i a t e ds e r i n e ／t h r e o n i n ep r o t e i nk i n a s e ，R o c k ) 是迄今为止 功能研究最为清楚的R h o 下游靶效应分子之一活化的G T P R h o 可以和R o c k 相互 作用而激活R o c k 通过与R h o 相互作用，R o c k 在肿瘤细胞的转移过程中参与调控 细胞迁移和侵袭 肿瘤的侵袭和转移是世界上癌症患者死亡最常见的原因最近，越来越多的 研究报道表明，m i R N A 与肿瘤细胞的侵袭和转移有关，其调控肿瘤细胞侵袭和转 移的作用机制成为m i R N A 研究领域的热点之一。

在m i R N A 与l m o 瓜o c k ．1 传导 通路的关系中，K o n g 等人在鼠正常乳腺上皮细胞中发现，m i R ．1 5 5 在T G F ．p 诱导 的上皮间质转化以及R h o A 引起的细胞迁移侵袭过程中具有重要作用T W I S T l 能够诱导m i R ．1 0 b ，m i R ．1 0 b 通过直接转录后抑制H O X D l 0 的表达来间接的增加 R h o C 的水平，从而影响了肿瘤细胞的迁移和侵袭研究黜l o 和m i R N A s 之间的关 系加强了m i R N A 在肿瘤形成中的重要性，并且为癌症转移的患者提供了新的治疗 策略 m i R ．1 2 5 a 是一种功能以及机制尚未研究清楚的m i R N A s 之一Y a n a i n h a r a 等人发现m i R ．1 2 5 a 定位在1 9 q 1 3 ．4 1 ，并用m i R N A 芯片分析了1 0 4 对肺癌组织以 及相应的癌旁肺组织，发现与癌旁肺组织相比较，m i R ．1 2 5 a 在肺癌组织中下调表 达至目前为止，已发现的成熟体m i R ．1 2 5 a 家族有两个成员，即h s a - m i R ．1 2 5 a ．3 p 和h s a - m i R 一1 2 5 a - 5 p 。

本研究目的旨在探讨非小细胞J ] 椭( n o n - s m a l lc e l ll u n gc a n c e r , N S C L C ) 组织中h s a —m i R 一12 5 a - 3 p 和h s a - m i R 一12 5 a 一5 p 的表达及其临床意义，分析 h s a - m i R 一1 2 5 a - 3 p 和h s a - m i R 一1 2 5 a - 5 p 与N S C L C 细胞系转移潜能的关系并在细 胞水平上，通过向肺癌细胞中转染正义和反义的2 - O ．甲基寡核苷酸的方法，探讨 增加h s a - m i R 一1 2 5 a - 3 p 和h s a —m i R 一1 2 5 a - 5 p 的表达以及下调h s a - m i R ．1 2 5 a - 3 p 和 h s a - m i R ．1 2 5 a ．5 p 的表达对R h o ／R o c k l 途径，以及肺癌细胞迁移和侵袭能力的影响， 为h s a ．m i R ．1 2 5 a ．3 p 和h s a - m i R ．1 2 5 a 一5 p 可能是R h o ／R o c k l 信号通路非常重要的调 节因子提供依据。

材料与方法 l 、N S C L C 组织标本 5 2 例配对的非小细胞肺癌和癌旁肺组织( 远离原发灶) 标本均来自中国医科 大学病理教研室患者术前均未接受过任何化学或放射治疗福尔马林固定石蜡 包埋的肿瘤组织切片常规进行H E 染色，分别由两名病理诊断医师，根绝W H O 肺及肺膜肿瘤分类标准( 2 0 0 4 ) 和T N M 分期系统( 1 9 9 7 ) ，确定肿瘤的组织学分 型以及临床病理分期5 2 例N S C L C 包括：男性3 3 例，女性2 9 例；年龄4 0 " - 7 8 岁( 平均5 8 岁士9 岁) ；鳞癌2 2 例，腺癌3 0 例；病理分级，高分化8 例，中分化 2 8 例，低分化1 6 例；病理分期，I 期1 8 例，I I 期1 5 例，I I I 期1 9 例：淋巴结转 移2 0 例，无淋巴结转移3 2 例5 2 例配对组织在液氮中快速冰冻，以后用于提 取m R N A 常规病理检查手术切除的肺门、纵膈以及肺内淋巴结，用于确定肺癌 的淋巴结转移情况患者的临床病理参数包括性别，年龄，组织学类型，病理分 级，病理分期，淋巴结转移，摘自患者的病历资料 2 、细胞培养 冻存于液氮的A 5 4 9 细胞经复苏后，用D M E M 培养液( 含有1 0 ％新生牛血清， 2 1 0 0u ／m l 的青霉素和1 0 0l a g ／m l 的链霉素) ，在3 7 。

C ，5 ％C 0 2 饱和湿度条件下培养， 经3 次传代稳定后，进行转染 3 、细胞转染 2 - O ．甲基寡核苷酸( 2 - O ．M e ．s e n s e ．3 p ：5 ’．A C AG G U G A GG U U C U U G G G A G C C - 3 ’2 - O —M e —a n t i s e n s e - 3 p ：5 - G G CU C CC A AG A AC CUC A CC U G U 一3 ’， 2 - O - M e - s c r a m b l e - 3 p ：5 ’- G G U C G G U G CU C GA U GC A GG U A A - 3 ’， 2 - O —M e —s e n s e 一5 p ：5 - U C C C U GA G AC C CU U UA A CC U G U G A 一3 ’， 2 - O —M e - a n t i s e n s e - 5 p ：5 - U C AC A GG U U 』气A AG G GU C UC A GG G A 一3 ’． 2 - O ．M e ．s c r a m b l e ．5 p ：5 - G G AC GGC G A U C A G A U A A G A G UU C U ．3 ’．) 用结合 D N A 技术合成( G e n e C h e m ，C h i n a ) 。

L i p o f e t a m i n e T M2 0 0 0 ( I n v i t r o g e n ，U S A ) 将 2 0 p M2 - 0 ．甲基寡核苷酸转染入6 孔板中A 5 4 9 和S P C 细胞中为R N A 提取和t r a n s w e l l 备用u n t r e a t e d 为未加任何处理因素的细胞，s c r a m b l e 为转染乱码序Y U 2 ’．O 一甲基寡 核苷酸的细胞，s e n s e 为转染正义序Y 0 2 - O ．甲基寡核苷酸的细胞，a n t i s e n s e 为转染 反义序列2 ’．O ．甲基寡核苷酸的细胞其中对照组细胞为( u n t r e a t e d 和s c r a m b l e ) 4 、R e a l ．t i m eP C R 根据操作说明应用T a q M a nM i c r o R N A 试剂检测成熟体m i R N A ( A p p l i e d B i o s y s t e m s ，U S A ) 所有的R T 产物，在A B IP r 。