实验室做细胞常用染色.docx

实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法一、爬片前盖玻片处理方法对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片.为了保证细胞 在长时间的染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上在载 玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一 能促进细胞黏 附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法1、 将载玻片用玻璃专用洗涤剂（如Decon）浸泡5min，间或振荡2、 用自来水冲洗 5min3、 以1%盐酸一70%乙醇溶液浸泡5min4、 烤箱干燥（至此即可用于普通染色）5、 多聚L—赖氨酸（1： 10溶于去离子水）浸泡5min ,振荡6、 入609烤箱1 h ,或室温过夜干燥（用于细胞化学、免疫细胞化学及原 位杂交细胞化学）二、细胞固定常用方法固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避 免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去 活性，防止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确 定位，并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏同时，固定还可使 细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。

1固定组织、细胞的基本原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、 对象、目的和要求选择固定剂和固定方法2. 培养物的准备和固定前处理：各种细胞培养物,如双盖片悬滴培养物、悬 液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料对双盖片悬滴培养 物和悬液培养物来说，常通过离心收集细胞，PBS漂洗2~3次后，备固定制 片；对盖片单层培养物来说，将盖片从培养器皿中取出后,PBS液漂洗2~3 次，以洗去血清和附着于细胞表面的残渣，备固定用3. 常用固定液：常用的固定液分两类，一类是以单一化学物质配成的固定 液，称简单固定液主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味 酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇(锇酸)另一类是用两种或 两种以上化学物质配合成的固定液，称混合固定液如Mueller固定液、 Flemming固液、FAA固定液、Carnoy固定液、Rossman固定液、Altmann固定 液、Bouing固定液等不同的固定液对细胞的化学成分、酶类及细胞结构固定 效果不同因此，选择合适的固定液是达到固定目的的基础1) 4%甲醛一PBS：甲醛是一种气体，其饱和水溶液无色，约含40%甲 醛。

在很多情况下，甲醛常常产生多聚甲醛的白色沉淀4%甲醛一PBS使组织 变硬速度比乙醇快，并能较好地保存组织的外部形式,固定效果不受制片影响， 固定材料可用苏木精和其他合成染料染色甲醛的穿透力较强，对组织固定均 匀，能增强组织的弹性，大标本的固定和保存多用甲醛甲醛是染色体、线粒 体和高尔基体的固定液，在冷冻切片中,甲醛作固定剂具有显著的优点.用40% 甲醛水溶液：PBS=1:9配方制备甲醛固定液2) 丙酮：丙酮为无色易挥发液体，用纯冷丙酮(49)固定细胞内酶效果较佳3) 乙醇：乙醇又称酒精，固定血纤维蛋白、色素、弹性纤维、细菌和白 细胞等效果优良无水乙醇或乙醇和醋酸的混合液是固定肝糖原及肌糖原的良 好固定液乙醇除有固定作用外，还具有硬化和脱水的作用.作为固定用乙醇的 适宜浓度为70%~ 100%乙醇的缺点是渗透力差，并使组织收缩4) 醋酸：常用0.3%~5%浓度的醋酸作固定剂醋酸能和水及乙醇、甲醇 溶合，醋酸不固定蛋白质，但能固定核酸醋酸的穿透力很大，它对细胞的膨 胀作用显著，这是由于它破坏了某些蛋白质分子的结合,所以,常用醋酸来减少其 他固定剂引起的细胞收缩 细胞学技术中， 它能防止细胞收缩, 并能较好地保 存染色体,还能把染色质沉淀成为可染色的块状体.(5) 苦味酸：苦味酸是黄色结晶体，强酸，可溶于水、乙醇、苯和二甲苯， 在水中的溶解度可因水温变化而变化。

苦味酸可以沉淀白蛋白、核蛋白、球蛋 白、组蛋白和核酸苦味酸的穿透力很慢，单独使用时,造成组织严重收缩它 和其他药物混合配制时，可以作为蛋白质的沉淀剂，同时可避免组织收缩、硬 化，而且易于染色所以在很多混合固定液中被广泛采用作固定用的最适浓 度为 1 %.(6) 锇酸(四氧化锇)：锇酸是一种强氧化剂,不能同乙醇和甲醛混合使用 它的挥发性很强，挥发出来的气体能固定结膜，对眼睛很有害，所以操作时应 特别注意四氧化锇是保存细胞结构的最好固定剂之一，配制时先在棕色试剂 瓶中盛入50- 100ml 01mol/L磷酸缓冲液(pH7.0~74)，再将装有1g锇 酸的安培瓶放人PBS中，以玻棒击碎安培瓶，摇荡使锇酸溶解，备用常用的固 定液浓度为 1%~2%7）戊二醛：戊二醛对组织的渗透率高，与蛋白质反应快，能较好地保存蛋白质，对微管和膜性结构保存亦比较好，并能较好地保存糖原常用的戊二 醛固定液配制方法列于表 12-1表 12 — 1 常用的戊二醛固定液配制方法Ph72的O.lmol/L磷酸缓冲液（ml）969692908825%戊二醛水溶液（ml） 4681012戊二醛的终浓度1%15%2%2.5%3%（8）甲醇／醋酸固定液：甲醇：醋酸为 3：1 的固定液是应用最广的一种培 养细胞固定剂。

甲醇穿透力好,醋酸固定蛋白效果好，两者结合，能使固定细胞 形态不变不仅最适用于固定染色体，而且固定的染色体适于 Giemsa 染色（注 意：此固定液宜现用现配）9）FAA固定液:此固定液适用于固定盖片单层培养的细胞，固定效果好 配制方法：90ml 80%酒精中加5ml冰乙酸和5ml40%甲醛.（lO）Carnoy固定液:Carnoy固定液是较好的非水溶性固定液，是显示细胞 化学成分（如粘多糖等）时常用的固定剂，固定、保真效果好，但穿透力差，适 于固定培养的单层细胞配制方法：60ml纯酒精加30ml氯仿和10ml冰乙酸ll）Bouin固定液：用于固定双盖片法培养的标本，固定30分钟后，用70% 酒精褪去苦味酸黄色,如不立即染色，可将标本保存在70%酒精中本试剂适于 固定组织细胞的糖原配制方法：先将75ml饱和苦味酸（100ml水中加14g）过滤，加入25ml福尔马林（40%甲醛，有沉淀时禁用），最后加入5ml冰 醋酸，混和后存于49冰箱中备用冰醋酸最好在临用前加入该固定液对组 织细胞穿透力较强，固定效果较好，保存的细胞结构完好•但因偏酸（pH为3~ 3.5），对抗原有一定损害12） 4%多聚甲醛一PBS固定液：多聚甲醛为白色固体，在50ml蒸馏水中 加入4g多聚甲醛，加热至60~70°C时，边搅拌边逐滴加入2mol/LNaOH，至液 体清晰透明。

用1mol/LHCl调节pH至74，冷却后加入0.01mol/LPBS液至 100ml,4C保存本试剂适于固定肾纤维蛋白和细胞骨架蛋白三、常见的细胞染色方法1 普通染色观察苏木精-伊红（hematoxylin—eosin,HE）染色和Giemsa染色是观察培养细胞 一般形态的最常用方法, 也是把细胞作为标本保存的主要方法 对于贴壁培养 的细胞，以生长于盖玻片和塑料培养瓶壁者便于操作固定前先用Hanks液、 PBS、BSS 或生理盐水清洗培养物 2次，去除妨碍染色的血清固定后可将盖 玻片用树胶贴于载玻片上，以利操作对于悬浮培养细胞,须先经离心沉淀 （1000r／min，10min） ， 弃上清液后（留少量液体） ， 将细胞悬液滴于玻片上做成涂片, 冷风吹干1HE染色法1.1 1染液配制（1）苏木精染液：这里介绍鄂征（1995）改良的Mayer法•称取0.5g苏木 精， 5.0g铵矶或钾矶，O.lg碘酸钠加温溶于70ml蒸馏水再加入30ml甘油，2ml 冰醋酸过滤后即成母液可长久保存用蒸馏水以 1：20稀释即成工 作液,可用很长时间每次染色前宜过滤，去除氧化膜2) 伊红染液：伊红有醇溶性与水溶性之分。

将0.5g伊红溶于 100m170%乙醇或蒸馏水即成工作液2 染色程序(1 )用10%甲醛(福尔马林)固定培养物30min，或以丙酮固定15min2)蒸馏水洗1次后，入苏木精染液5 ~ 10min染细胞核3 )入0.5%盐酸-70%乙醇溶液30~1min,脱去胞质的着色此时核呈 紫红色 4)入碱性溶液碱化,使细胞核变成蓝色如果时间允许，最好用自来水 (呈弱碱性)长时间浸泡也可入1%NaHCO3溶液此过程须不断用显微镜监 视，以掌握碱化时间5 )蒸馏水洗1 min，去除残留的碱性溶液，否则影响伊红着色.(6 )入伊红染液30s ~ 1 min 7)用梯度乙醇溶液脱水:70%、90%、95%乙醇各 30s~1 min；100%(2 次)各2min如伊红为乙醇溶液，略去70%乙醇.( 8)用二甲苯透明 2 次，各 5min9)树胶封固3 染色结果细胞核呈紫蓝色或深蓝色,大部分细胞的胞质呈粉红色如果胞质内含较多 核糖体(例如淋巴细胞)则亦呈蓝色.12 吉姆萨染色法此法可将细胞核与胞质同时染色，故便捷快速;但染液配制技术不易准确掌 握,效果常不如 HE 染色稳定1吉姆萨(Giemsa)染液的配制(1) 取1.5g吉姆萨粉末放入50ml甘油，置于609温箱，约3h后溶解.(2) 取出后倒入50ml中性甲醇，即为母液。

于棕色瓶可长久保存需要 注意的是,有的甲醇内含醋酸，会使染液中的伊红沉淀出来，不利染色 3)将母液与 0.1 mol／LPBS(Ph6 9~7.2) 按 1：9混合即成工作液吉姆萨染■: - ：■ I,"； I液对pH极敏感，偏酸时染色过红,偏碱时则过蓝所以，工作液宜现用现配，八史丨「「出汕!::汨乂…面镜状，办稍多甲醇研磨，配制成讯ki染液，转入棕色广口瓶中保存封存两个以丄 ■'!保存时间不超过48h以免被CO2酸化染色疔法:“ '1门八丄(1)将标 t.Fi「心将标上细胞名少酌情而定)(2 )入吉姆萨液染色110」；15小希.可用染色缸;或将染液滴覆于标本「打f ； 表面张力而终止栗色液加入，染色3€min左右⑸用超纯水缓慢冲洗至少3分钟以上.待干3) 蒸馏水清洗，空气干燥,二甲苯透明，树胶封固3 染色结果细胞核呈蓝或蓝紫色，胞质呈色与HE染色相仿。