药靶或协同药靶及药物机理的研究思路之一.doc

药靶或协同药靶及药物机理的研究思路之一药靶或协同药靶及药物机理的研究思路之一By季博今天跟大家分享的nature是关于药物和靶点的药物是Lenalidomide , 治疗的疾病是由于染色体5q缺失(del ( 5q ))导致的骨髓增生异常综合症 (myelodysplastic syndrome , MDS ) naturel4610.pdf , Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CKla in del(5q)MDSo 全文上 传 群 188462716 )这个疾病季博不了解这篇文章做的是药物Lenalidomide作用的机理解 释药物为什么有效几个背景,Lenalidomide可结合CRBN (也就是直接药靶,直接结合), CRBN为CRL4泛素连接酶的adaptor药物结合后,可加速IKZF1和IKZF3 的降解加速T细胞释放IL2Lenalidomide可加速del ( 5q )的MDS细胞凋亡作者就想看看 Lenalidomide是导致什么东西降解从而使得del ( 5q )的MDS细胞凋亡解 释药物作用的机理。

其实这个非常重要,科研中，机制是做得越清晰越好在药 物开发中也是一样药物作用的机理越清晰越好如果出现副作用，或耐药,知 道机理,就可以进行修补—、Lenalidomideinduces degradation of CKla开始找差异蛋白了大家看思路细胞模型，为del ( 5q )的骨髓细胞系KG-1在加药和不加药的情况下，做SILAC-MS寻找加药后，出现差异的蛋白因为涉及到泛素的修饰，所以， 这里一定要采用质谱来检测差异蛋白)发现CRBN的泛素化水平下降JKZF1泛素化水平上升与以往的研究一致大家注意，这个就是季博以前说的,别人的结论需要在自己的研究中做下验证, 以证明自己的体系是可以重复出前人的结果的证明体系没有问题)在此基础上，新发现CKla泛素化水平上升CKla是定位在del ( 5q )的缺失区域的CKla在前人的研究中认为可以作为骨髓瘤的药靶二、CKla is asubstrate of CRL4CKla有改变，那么是否为直接的泛素化底物呢在多个细胞内加入药物，检测CKla,发现蛋白水平下降mRNA不变这 个改变可以被蛋白酶抑制剂MG132所抑制也可被泛素连接酶的抑制剂 MLN4924所抑制。

说明Lenalidomide对CKla的调控是通过泛素化和蛋白降 解文章高大上的一步，采用cas9技术把CRBN敲除，发现Lenalidomide对 CKla的降解调控消失了说明Lenalidomide对CKla的降解调控需要CRBN 其实很好理解，因为Lenalidomide可结合CRBN ,而CRBN是泛素连接酶的 adaptor.文章中是采用新技术，再次验证了这个结论然后做了下,CKla与CRBN间是否为直接互作发现只有在Lenalidomide 存在的情况下,CKla可以与CRBN直接结合且做了区段分析，发现CKla的 1-177氨基酸是负责其接受Lenalidomide泛素化调控的关键位点这里的区段分析，跟平时的不一样采用了同源蛋白分析的方法，很巧妙的方法不过要注 意，成功了是OK的不成功,重新想办法，呵呵三、Effect ofCSNKlAl expression levelCKla由基因CSNK1A1编码下面就开始对CKla进行功能实验了CKla在其他研究中已经证明可以抑 制p53的活性，跟凋亡相关文章中就采用慢病毒介导的shRNA，把CSNK1A1 干扰后，检测凋亡发现，干扰后，抑制增殖或存活。

加入Lenalidomide后,CSNK1A1干扰的细胞更加敏感Tips这里说明CSNK1A1是Lenalidomide的增敏药靶，呵呵这个增敏药靶是直接药靶的下游(做药靶或协同药靶研究的Llll记住这点，呵呵当耐药发生时，可以往直接药靶下游找找协同药靶)有了这个结论开始做过表达实验了相当于rescue实验拿的是病人的细胞，在CSNK1A1缺失的细胞中，过表达CSNK1A1 z看对Lenalidomide的 敏感性发现过表达CSNK1A1可降低细胞对Lenalidomide的敏感性很棒的 数据不过大家注意，del( 5q )细胞少CSNK1A1 ,对药物敏感过表达CSNK1A1 后，敏感度下降但是，在正常细胞中过表达CSNK1A1 ,看不到这个效应这就是季博讲座中说的,过表达，很可能会有假阴性因为细胞内已经有很 多了 ，再加进来，可能看不到效果四、Species-specificeffects of lenalidomide这篇文章真的是需要好好学习作者发现lenalidomide在小鼠细胞中无效联想到lenalidomide的直接结合靶点是CBRN，就把人的CBRN在小鼠细胞中 表达,再看看是否有效。

结果，有效了说明lenalidomide在小鼠中无效,是 由于人的CBRN和小鼠CBRN结构的不同也是个巧妙的实验不过,大家还 是要注意,成功了 OK不成功,不要下否定结论因为CBRN得下游，小鼠的 基因是否可以应答人的CBRN ,是不知道的需要辩证的看问题猜测这篇文章的作者是搞蛋白结构和进化的，至少熟悉这个领域作者把小 鼠和人的CBRN进行chimaeric分析发现在C端负责与lenalidomide结合且鉴定为一个氨基酸，V387把小鼠中对应的氨基酸改为V后,可以使得小鼠 细胞对lenalidomide进行应答很厉害的实验这里，做敲除动物，只知道人的位点，不知道小鼠位点的筒子们，这里的思路和方法可参考在晶体结构上，这个位点，AV387 ,小鼠1391 ,其实并不直接跟lenalidomide结合但在这个区域内然后作者做了结构分析根据结果，构建了转基因鼠也就是获得了小鼠模型转基因鼠上,对 lenalidomide 存在应答五、Differentialsubstrate specificity有了模型，就可以做工作了把几个药物进行了检测讨论这几个药物为啥 有的有效，有的无效工作做细了这篇文章的思路，没有什么特殊之处，为经典的研究思路（有不清楚的筒子， 可看季博前面的文章）。

基因也没有什么新意，但作者把工作做细了对于药靶 和协同药靶研究很有借鉴意义。