STAT3靶向短发夹RNA干扰重组载体对结肠癌SW480细胞.doc

KKME---专业医学搜索引擎 靶向短发夹靶向短发夹 RNA 干扰重组载体对结肠癌干扰重组载体对结肠癌SW480 细胞细胞【摘要】目的 探讨 STAT3 基因短发夹 RNA(shRNA)表达质粒对结肠癌 SW480 细胞 STAT3 基因的干扰作用方法 根据 siRNA设计原则，构建靶向 STAT3 基因的短发夹 RNA 干扰质粒(pGPU6/GFP/STAT3),使用脂质体法转染人结肠癌细胞系(SW480)，通过 RTPCR 和 Western 印迹检测结肠癌 SW480 细胞 STAT3 基因 mRNA 和蛋白表达水平结果 pGPU6/GFP/STAT3 重组质粒经限制性内切酶酶切及测序证明基因插入正确质粒成功转染 SW480 细胞后，该细胞的 STAT3 mRNA 和蛋白表达明显下降(P<0.05)结论 成功构建靶向 STAT3 基因的 shRNA 表达载体，转染 SW480 细胞，能有效抑制细胞的 STAT3 mRNA 和蛋白表达，为 STAT3 基因靶向治疗提供前期的实验依据关键词】 结肠癌;STAT3;RNA 干扰;基因表达信号传导及转录活化因子 3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)是转录信号传导子与激活子家族(STAT)的重要成员，是研究干扰素(IFN)信号转导机制的过程中发现的一种转录因子，可以在外界信号的刺激下激活并直接转入细胞核内引发相应靶基因的转录。

近年来研究发现，STAT3 是EGF，IL6/JAK，Src 等多个酪氨酸激酶信号通道汇聚的焦点,具有强烈的抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的作用，参与了人类恶性肿瘤KKME---专业医学搜索引擎 目前，研究表明结肠癌细胞系 SW480 和 HCT116 增殖过程中 STAT3 蛋白表达与活化过程增强，提示 STAT3 过度表达和持续活化可能与结肠癌的发生、发展有关〔7〕 因此，本实验设计和构建针对 STAT3 基因表达的短发夹 RNA(shRNA)重组质粒，转染结肠癌 SW480 细胞，观察重组质粒对细胞 mRNA 和蛋白表达的抑制作用，以期为结肠癌的基因靶向治疗提供新的靶点和为进一步的实验研究奠定基础1 材料与方法1.1 材料 人结肠癌细胞株 SW480 细胞购自中山肿瘤细胞库;胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司;RPMI1640 培养液购自莱德尔公司;质粒 pGPU6/GFP/Neo、大肠杆菌 DH5Α 为上海吉玛公司产品;Lipofectamine2000 脂质体转染试剂盒和 trizol 试剂购自 Invitrogen公司;各种工具酶购自 Fermentas 公司;STAT3 单克隆抗体购自 Abcam公司;PCR 引物和 shRNA 表达载体插入片段的寡核苷酸链由上海吉玛公司合成;STAT3 shRNA 表达载体测序由上海英俊生物有限公司完成。

1.2 方法1.2.1 shRNA 表达载体的设计及合成 根据 NCBI 提供的人类 STAT3 基因结构(Gene ID：6774)和 shRNA 的设计原则，参考相关文献选取特异性序列为干扰作用的靶点〔8〕 ，设计合成 4 个可干扰序列，并设计一条经 BLAST 检索与现有基因文库中所有人源基因均无同源性的非特异性序列为阴性对照序列shRNA 模板中的KKME---专业医学搜索引擎 结构选用了 TTCAAGAGA 以避免形成终止信号，shRNA 的转录终止序列采用 T6 结构正义链模板的 5′端添加了 CACC，与BbsⅠ酶切后形成的黏端互补;反义链模板的 5′端添加了 GATC，与BamHⅠ酶切后形成的黏端互补;如果 siRNA 的第一个碱基不是 G，则在 CACC 后补加一个 GSTAT31 正义：5′CACCGCAGCAGCTGAACAACATGTTCAAGAGACATGTTGTTCAGCTGCTGCTTTTTTG3′;反义：5′GATCCAAAAAAGCAGCAGCTGAACAACATGTCTCTTGAACATGTTGTTCAGCTGCTGC3′;STAT32 正义：5′CACCGAGTCAGGTTGCTGGTCAAATTCAAGAGATTTGACCAGCAACCTGACTTTTTTTG3′;反义：5′GATCCAAAAAAAGTCAGGTTGCTGGTCAAATCTCTTGAATTTGACCAGCAACCTGACTC3′;STAT33 正义：5′CACCGCATCTGCCTAGATCGGCTATTCAAGAGATAGCCGATCTAGGCAGATGTTTTTTG3′;反义：5′GATCCAAAAAACATCTGCCTAGATCGGCTATCTCTTGAATAGCCGATCTAGGCAGATGC3′;STAT34 正义：5′CACCGGCGTCCATCCTGTGGTACAATTCAAGAGATTGTAKKME---专业医学搜索引擎 GTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC3′。

1.2.2 重组质粒的构建 将 DNA oligo 分别用 TE(pH8.0)溶解，浓度为 100 Μmol/L取相应的正义链和反义链 oligo 溶液，退火在 PCR 仪上按照如下程序进行退火处理：95℃ 5 min;85℃ 5 min;75℃ 5 min;70℃ 5 min;4℃保存退火处理后得到浓度为 10 Μmol/L 的 shRNA 模板将所得模板溶液稀释 500 倍，终浓度为 20 nmol/L，用于连接反应pGPU6/GFP/Neo 载体的线性化，取 2 Μg pGPU6/GFP/Neo 载体，进行 BbsⅠ和 BamHⅠ双酶切处理，37℃酶切 1 h，琼脂糖电泳，使用 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0回收，电泳检测估算浓度，稀释浓度至 50 ng/Μl进行载体连接，连接产物转化感受态大肠杆菌 DH5Α，每个连接反应挑取 5 个菌落，PCR 验证阳性克隆为检测目的基因是否正确插入及有无基因突变的产生，阳性克隆送上海英俊生物有限公司测序1.2.3 质粒转染 SW480 细胞在 10%FBS 的 RPMI1640 培养液中，37℃，5% CO2 条件下培养。

取对数生长期的 SW480 细胞以KKME---专业医学搜索引擎 个/孔接种于 6 孔板，待细胞丰度带到 80%时，用Lipofectimane2000 试剂 10 Μl 转染重组质粒 4 Μg，转染 6 h 后更换无双抗的 10%FBS 的 RPMI1640 培养液继续培养 48 h转染细胞分为 7 组，①空白对照组;②转染 STAT31 质粒组;③转染 STAT32质粒组;④转染 STAT33 质粒组;⑤转染 STAT34 质粒组;⑥转染阴性质粒组;⑦脂质体对照组1.2.4 RTPCR 检测 STAT3 mRNA 表达 Trizol 提取细胞总RNA，将抽提得 Total RNA 进行逆转录，制备 cDNA 模板以 2 Μl 的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，5 S rRNA 为内参照STAT3 引物序列为：上游 5′CTGCCTAGATCGGCTAGAAAACT3′，下游 5′TTCTAAACAGCTCCACGATTCTC3′，扩增片段为170 bp;5S rRNA 引物序列为：上游5′ACGGCCATACCACCCTGAAC3′，下游5′GGCGGTCTCCCATCCAAGTA3′，扩增片段为 91 bp。

荧光定量 PCR 反应条件：95℃ 3 min;95℃ 30 s;62℃ 40 s;第 2 至第 3 步共 40 个循环PCR 反应结束后取 5 Μl 产物用 3%琼脂糖凝胶(内含嗅化乙啶)电泳,紫外灯下观察并用凝胶成像系统成像，通过FTC2000A 检测样本 Ct 值1.2.5 免疫印迹(Western 印迹)检测 STAT3 蛋白表达 细胞转染 72 h，经胰酶消化后收集细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，加入预冷至 4℃的裂解缓冲液,冰上作用 20 min 后 12 000 r/min，离心 2 min 后，上清液保存于-20℃采用 Bradford 法测定蛋白质浓度，以KKME---专业医学搜索引擎 Μg/孔上样，12%十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)凝胶电泳分离，通过电转移法将蛋白质从SDSPAGE 凝胶转移至硝酸纤维素膜后者在含 5%脱脂奶粉的TTBS 中 37℃封闭 90 min，加入一抗 4℃孵育过夜;TTBS 充分漂洗(10 min×3 次)，加入二抗 37℃作用 40 min，TTBS 充分漂洗(10 min×3 次);化学荧光法(ECL)显色,以 Βactin 蛋白为内参照，放入KODAK Image Station 2000MM Digital Imaging System，曝光获取图像。

分别分析灰度值，比较各组蛋白表达量1.3 统计学处理 应用 SPSS13.0 统计软件进行数据分析计量资料以 x±s 表示,原始资料应用方差分析2 结 果2.1 pGPU6/GFP/STAT3 重组质粒的 PCR 鉴定 挑选单克隆菌株，接种到含 50 Μg/ml 卡那霉素的 LB 培养集中，振荡过夜，使用碱裂解法抽提质粒，所得质粒用 BamHⅠ，PstⅠ分别酶切鉴定阳性重组载体可以被 BamHⅠ切开，而不能被 PstⅠ切开见图 1M：lamda/Eco130I;最左上侧 1～5 为 STAT31(1～5)Pst I酶切结果，6～10 为 STAT32(1～5)Pst I 酶切结果;其右侧 1～5 为STAT31(1～5)BamH I 酶切结果，6～10 为 STAT32(1～5)BamH I 酶切结果;最左下侧 1～5 为 STAT33(1～5)Pst I 酶切结果，6～10为 STAT34(1～5 Pst I 酶切结果;其右侧 1～5 为 STAT33(1～5)BamH I 酶切结果，6～10 为 STAT34(1～5)BamH I 酶切结果图 1 重组载体的酶切鉴定图KKME---专业医学搜索引擎 荧光定量 RTPCR 结果 通过荧光定量 PCR 检测STAT3 基因 mRNA 表达，以 5S rRNA 为内参照，扩增片段大小与所设计的目的基因大小一致，STAT3 和 5S rRNA 设计扩增片段分别为 170 bp 和 91 bp，通过 FTC2000A 检测各样本 Ct 值比较各组STAT3 mRNA 的表达情况。

4 个 pGPU6/GFP/STAT3 重组质粒组(2、3、4、5 组)转染 SW480 细胞的 STAT3 mRNA 表达较对照组显著下降(P<0.05)，4 个 pGPU6/GFP/STAT3 重组质粒组对 STAT3 基因的抑制率分别为 55%、69%、60%和 54%见图 32.2 pGPU。