DNS氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析ppt课件.ppt

DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析薄层层析〔薄层层析〔Thin-layer￿Thin-layer￿chromatography,TLC)chromatography,TLC)o薄薄层层析析o ---是吸附是吸附剂在平滑的玻璃板或聚脂薄在平滑的玻璃板或聚脂薄膜上膜上铺成薄成薄层作作为固定相，以溶固定相，以溶剂作作为流流动相，将相，将样品中各品中各组分分分分别的方法o分分别原理：原理：o——吸附吸附层析析吸附层析的概念及原理吸附层析的概念及原理o吸附吸附o ---一种物质被聚集在另一种物质外表一种物质被聚集在另一种物质外表的景象o吸附剂：吸附剂：o ---凡是可以将其他物质聚集到本身分凡是可以将其他物质聚集到本身分子外表的物质称为吸附剂，如氧化铝、硅子外表的物质称为吸附剂，如氧化铝、硅胶等o被吸附物被吸附物o ---聚集在吸附剂外表的分子就称为被聚集在吸附剂外表的分子就称为被吸附物吸附层析〔吸附层析〔Absorption￿Absorption￿Chromatography)Chromatography)o各组分与流动相分子争夺吸附剂外表各组分与流动相分子争夺吸附剂外表活性中心活性中心, ,利用吸附剂对不同组分的吸利用吸附剂对不同组分的吸附才干差别而实现分别附才干差别而实现分别. .主要是利用吸附剂对不同物质吸附力主要是利用吸附剂对不同物质吸附力的不同而到达分别的目的。

的不同而到达分别的目的薄层层析中吸附剂选择是关键薄层层析中吸附剂选择是关键吸附剂吸附剂吸附剂的选择吸附剂的选择〔〔1〕应不溶于所运用的溶剂〕应不溶于所运用的溶剂;与所运用的与所运用的溶剂和样品中各组分不起化学反响；溶剂和样品中各组分不起化学反响；〔〔2〕应具有较大的吸附外表〔吸附容量〕〕应具有较大的吸附外表〔吸附容量〕和一定的吸附力和一定的吸附力;对被分别个组分有不同对被分别个组分有不同的吸附力的吸附力,有足够的分辨力；有足够的分辨力；〔〔3〕吸附剂颗粒大小要均匀，坚持良好的〕吸附剂颗粒大小要均匀，坚持良好的反复性吸附剂的吸附才干吸附剂的吸附才干o常称常称为活度，用活度，用罗马字母字母ⅠⅠ、、ⅡⅡ、、ⅢⅢ、、ⅣⅣ、、ⅤⅤ表示o o 活度活度 强 弱弱o 含水量含水量 多多 少少常用吸附剂常用吸附剂p极性：极性：p硅胶硅胶:p为首首选吸附吸附剂本身具微酸性，适用于分本身具微酸性，适用于分别酸性及中性物酸性及中性物质p氧化氧化铝:p氧化氧化铝具有分具有分别才干才干强、活性可以控制等、活性可以控制等优点点p碱性碱性/中性中性/酸性氧化酸性氧化铝p……p非极性：非极性：p纤维素素p聚聚酰胺：胺：p→→合成：己二酸、己二胺合成：己二酸、己二胺p→→特点：特点：氢键吸附吸附剂p……是是——类化学化学纤维原料，即原料，即锦纶( (又称尼又称尼龙) )。

由己二酸与己二胺聚合而成由己二酸与己二胺聚合而成Ø由于在由于在这类物物质分子中都含有大量分子中都含有大量酰胺基胺基团，，故故统称聚称聚酰胺聚酰胺聚酰胺——是由于聚是由于聚酰酰胺的胺的-C＝＝O(羰羰基基)及及>NH(氨基氨基)能与被分能与被分别别物物质质之之间间构成构成氢键氢键如酚如酚类类(包括黄包括黄酮类酮类、鞣、鞣质质等等)和酸和酸类类〔 〔如核苷酸、氨基酸等如核苷酸、氨基酸等)是以其是以其羟羟基与基与酰酰胺胺键键的的羰羰基构成基构成氢键氢键如硝基化合物和如硝基化合物和醌类醌类等物等物质质与与酰酰胺胺键键的氨基构成的氨基构成氢键氢键被分被分别别物物质质构成构成氢键氢键才干的才干的强强弱，确定吸附才干的差弱，确定吸附才干的差别别在在层层析析过过程中，展程中，展层层溶溶剂剂与被分与被分别别物物质质在聚在聚酰酰胺外表胺外表竞竞相构相构成成氢键氢键因此选择选择适当的展适当的展层层溶溶剂剂，使被分，使被分别别物物质质在溶在溶剂剂与与聚聚酰酰胺外表之胺外表之间间的分配系数能有的分配系数能有较较大差大差别别，，经过经过吸附与解吸吸附与解吸的展的展层过层过程，可以一一分程，可以一一分别别. 聚酰胺对极性物质的吸附作用聚酰胺对极性物质的吸附作用溶剂溶剂p不同溶不同溶剂具有不同的构造性具有不同的构造性质，依极性，依极性大小各种溶大小各种溶剂的洗脱才干各不一的洗脱才干各不一样。

p普通所普通所选溶溶剂要求：要求：pa.纯度合格度合格pb.黏度要小黏度要小→→易与易与样品中各品中各组分相分分相分别pc.与所欲分与所欲分别样品和吸附品和吸附剂不起化学反不起化学反响响溶剂选择思索要素溶剂选择思索要素1、溶剂与吸附剂之间的相互作用力、溶剂与吸附剂之间的相互作用力2、溶剂与样品之间的作用要素、溶剂与样品之间的作用要素溶剂的选择可经过实验来确定溶剂的选择可经过实验来确定薄层层析的操作薄层层析的操作1、点样、点样样品最好溶解在挥发性的溶剂中，如氯样品最好溶解在挥发性的溶剂中，如氯仿、丙酮等，防止用水每次点少量样品，仿、丙酮等，防止用水每次点少量样品，可在溶剂挥发后反复进展至点完为止可在溶剂挥发后反复进展至点完为止样品原点直径＜样品原点直径＜3mm2.平衡平衡3.展开展开方法：方法：上行层析法上行层析法下行层析法下行层析法双向展开法双向展开法显色显色1〕有色物质〔如黄体酮〕展开后即可显〕有色物质〔如黄体酮〕展开后即可显出斑点出斑点2〕紫外灯下显出荧光斑点，如核苷酸和〕紫外灯下显出荧光斑点，如核苷酸和某些生物碱某些生物碱3〕显色剂显色〕显色剂显色p荧光光试剂p￿￿￿——DNS-Cl￿￿￿——DNS-Cl二甲氨基二甲氨基萘磺磺酰氯p蛋白蛋白质、多、多肽、氨基酸可与其游离氨基、氨基酸可与其游离氨基结合合pDNS-aaDNS-aa发出黄出黄绿色色荧光光DNS-Cl在在pH过高高时，水解，水解产生副生副产物物DNS-OH，即：，即：在在DNS-ClDNS-Cl过量量时，会，会产生生DNS-NH2DNS-NH2，即：，即：DNS-氨基酸在紫外光照射下呈氨基酸在紫外光照射下呈现现黄色黄色荧荧光光DNS-OH和和DNS-NH2产产生生蓝蓝色色荧荧光光→可彼此区分。

可彼此区分 三、薄层层析的运用三、薄层层析的运用〔一〕定性分析：将知化合物作为规范品与样〔一〕定性分析：将知化合物作为规范品与样品一同进展层析后对照，可初步确定未知化品一同进展层析后对照，可初步确定未知化合物的组成合物的组成〔二〕定量分析：可直接在薄板上测定，无须〔二〕定量分析：可直接在薄板上测定，无须破坏薄层；破坏薄层； 用工具将斑点从薄层上取下，用溶剂洗脱，用工具将斑点从薄层上取下，用溶剂洗脱，再用其他方法测定再用其他方法测定临床生化上的运用临床生化上的运用1.氨基酸的分别氨基酸的分别2.核苷、核苷酸和核酸的分析核苷、核苷酸和核酸的分析DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析 p二甲氨基萘磺酰氯二甲氨基萘磺酰氯p(1-Dimethylaminonaphtalene-5-sulfonyl￿(1-Dimethylaminonaphtalene-5-sulfonyl￿chloridechloride，，DNS-Cl)DNS-Cl)可与氨基酸的游离氨基结可与氨基酸的游离氨基结合成合成DNS-DNS-氨基酸p构成的构成的DNS-DNS-氨基酸在紫外线〔氨基酸在紫外线〔260nm260nm或或365nm365nm〕照射下发出剧烈的黄色荧光，因此可用荧光〕照射下发出剧烈的黄色荧光，因此可用荧光检测检测DNS-DNS-氨基酸的存在。

氨基酸的存在pH9.840℃℃,30min本本实验中，聚中，聚酰胺上胺基与氨基酸胺上胺基与氨基酸的的羰基构成基构成氢键，，酰胺基胺基团上上羰基基与与AAAA中中羟基或酚基构成基或酚基构成氢键由于有些有些AAAA构造构造类似，如只采用一种溶似，如只采用一种溶剂系系统进展展单向向层析，析，难到达完全到达完全分分别的目的因此可的目的因此可选择另一溶另一溶剂系系统进展第二向展第二向层析 第一向第一向————苯－冰醋酸苯－冰醋酸 第二向第二向————甲酸－水甲酸－水二甲氨基萘磺酰氯〔二甲氨基萘磺酰氯〔DNS-ClDNS-Cl〕可与氨基酸的〕可与氨基酸的游离氨基结合成游离氨基结合成DNS-DNS-氨基酸构成的氨基酸构成的DNS-DNS-氨氨基酸在紫外光下呈黄绿色荧光基酸在紫外光下呈黄绿色荧光￿￿￿￿DNS-Cl￿+￿AA￿￿￿￿￿￿￿￿DNS-AA￿+￿HCl￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿DNS-Cl￿+￿AA￿￿￿￿￿￿￿￿DNS-AA￿+￿HCl￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿反响的副产物：反响的副产物：DNS-NH2黄色荧光和黄色荧光和DNS-OH蓝色荧光蓝色荧光显色显色DNS-氨基酸的双向层析图谱氨基酸的双向层析图谱ⅠⅡ颉颉亮亮苯苯丙丙赖赖甘甘丝丝天天脯脯谷谷1、、DNS－氨基酸的制备－氨基酸的制备2、混合、混合DNS－氨基酸的双向层析－氨基酸的双向层析〔〔1〕点样。

距右下角距两边各〕点样距右下角距两边各0.5cm，直径控制在，直径控制在2－－3mm之间，点在无光泽面之间，点在无光泽面,可反复几次点样可反复几次点样〔〔2〕苯－冰醋酸层析：展层剂前缘距薄膜顶端〕苯－冰醋酸层析：展层剂前缘距薄膜顶端3mm处处即可停顿即可停顿,冷风吹干，紫外察看冷风吹干，紫外察看〔〔3〕甲酸－水层析：调转〕甲酸－水层析：调转90度与第一相垂直，热风吹度与第一相垂直，热风吹干，紫外灯下察看，用铅笔悄然标志干，紫外灯下察看，用铅笔悄然标志操作以及本卷须知操作以及本卷须知〔〔1 1〕严厉控制点样位置以及点样直径〕严厉控制点样位置以及点样直径〔〔2 2〕展层时勿将点样浸入溶剂系统〕展层时勿将点样浸入溶剂系统〔〔3 3〕展层后必需经电吹风将膜吹干〕展层后必需经电吹风将膜吹干〔〔4 4〕运用紫外照射时要留意运用时间短〕运用紫外照射时要留意运用时间短. .留意留意Procedure for TLC1. Prepare the developing container.The developing container for TLC can be a specially designed chamber, a jar with a lid, or a beaker with a watch glass on the top:                                                                   Pour solvent into the beaker to a depth of just less than 0.5 cm. To aid in the saturation of the TLC chamber with solvent vapors, line part of the inside of the beaker with filter paper Cover the beaker with a watch glass, swirl it gently, and allow it to stand while you prepare your TLC plate. TLC plates used in the organic chem teaching labs are purchased as 5 cm x 20 cm sheets. Each large sheet is cut horizontally  into plates which are 5 cm tall by various widths; the more samples you plan to run on a plate, the wider it needs to be.Prepare the TLC plate.Shown in the photo to the left is a box of TLC plates, a large un-cut TLC sheet, and a small TLC plate which has been cut to a convenient size. Plates will usually be cut and ready for you when you come to lab.Handle the plates carefully so that you do not disturb the coating of adsorbent or get them dirty.Measure 0.5 cm from the bottom of the plate. Take care not to press so hard with the pencil that you disturb the adsorbent. Using a pencil, draw a line across the plate at the 0.5 cm mark. This is the origin: the line on which you will "spot" the plate. It's kind of hard to see the pencil line in the above photos, so here is a close-up of how the plate looks after the line has been drawn. Under the line, mark lightly the name of the samples you will spot on the plate, or mark numbers for time points. Leave enough space between the samples so that they do not run together, about 4 samples on a 5 cm wide plate is advised. Use a pencil and do not press down so hard that you disturb the surface of the plate. A close-up of a plate labeled "1 2 3" is shown to the right. Spot the TLC plate . . . swirl until dissolvedadd a few drops of solvent . . . dip the microcap into solution - the arrow points to the microcap, it is tiny and hard to see make sure it is filled - hold it up to the light if necessary touch the filled microcap to TLC plate to spot it - make sure you watch to see that all the liquid has drained from the microcap rinse the microcap with clean solvent by first filling it . . . . . . and then draining it by touching it to a paper towel here's the TLC plate, spotted and ready to be developed Develop the plate.place the TLC plate in the developing container - make sure the solvent is not too deepThe solvent will rise up the TLC plate by capillary action. In this photo, it is not quite halfway up the plate.In this photo, it is about 3/4 of the way up the plate.Remove the plate from the beaker.quickly mark a line across the plate at the solvent front with a pencilAllow the solvent to evaporate completely from the plate. If the spots are colored, simply mark them with a pencil.Visualize the spots Most samples are not colored and need to be visualized with a UV lamp. Hold a UV lamp over the plate and mark any spots which you see lightly with a pencil.this is a UV lamp here are two proper sized spots, viewed under a UV lamp (you would circle these while viewing them)The plate shows three compounds run at three different concentrations. The middle and right plate show reasonable spots; the left plate is run too concentrated and the spots are running together, making it difficult to get a good and accurate Rf reading. Here's what overloaded plates look like compared to well-spotted plates. The plate on the left has a large yellow smear; this smear contains the same two compounds which are nicely resolved on the plate next to it. The plate to the far right is a UV visualization of the same overloaded plate.The retention factor, or Rf, is defined as the distance traveled by the compound divided by the distance traveled by the solvent.。