小鼠肝脏RNA的抽提纯化与鉴定及逆转录.docx

小鼠肝脏RNA的抽提纯化与鉴定及逆转录（RT）-PCR实验名称：小鼠肝脏RNA的抽提纯化与鉴定及逆转录（RT）-PCR实验目的：1、 掌握 RNA 操作注意事项2、 了解 RNA 抽提原理3、 熟悉 RNA 抽提方法4、 了解鉴定 RNA 含量和质量的方法5、 了解逆转录（RT）-PCR方法实验原理：真核生物中绝大多数基因有内含子，如直接由基因组克隆目的基因，不利于编码基因的 序列分析及体外利用原核细胞表达提取 RNA 并逆转录形成 cDNA 或构建 cDNA 文库 是获取真核生物表达基因的主要手段 检测基因在转录水平的表达，需检测 mRNA 含量，定量 RT-PCR 是主要方法之一 实验基础：酸性酚法；四步骤 （组织或细胞匀浆、 分离总 RNA、 纯化 RNA、 检测 RNA 的纯度及完整性）酸性酚法：在酸性条件下苯酚可溶解DNA而不溶解RNA,同时酚又是蛋白变性剂利 用酸性酚试剂加氯仿共抽提，可一步完成细胞的裂解以及蛋白质与 RNA 的分离最后 利用异丙醇沉淀,即可获得纯化的总 RNA实验步骤：1、 准备工作：去除外源性 RNA 酶2、 处死小鼠3、 取小鼠肝组织匀浆，取肝50~100mg Trizol （酸性酚+异硫氰酸胍）1ml。

4、 加入氯仿0.2ml，剧烈振荡15s，室温放置10min12000rpm， 15min，取上清 置一新 EP 管 （离心后溶液分为三相，即上层的水相、下层的有机相以及中间的变性蛋白小心吸取上层水相，绝不能有中层蛋白混入5、 加入异丙醇0.5ml，振荡混匀，室温放置10min， 12000rpm,10min，弃上清 （加入 50％的异丙醇沉淀核酸异丙醇的用量应与以上所取上清液的体积相当6、 1ml 75%乙醇洗涤沉淀，12000rpm,5min，重复一次7、 空气干燥沉淀5-8min，溶解于20》l DEPC-H20留样2p l，其余一70°C保存备 用8、 RNA 的纯度与含量检测：紫外分光光度法高纯度 RNA 的 A260/A280 应处于 1.6 至 1.8 之间， A260 与 RNA 浓度呈正比， 1OD =40》g/ml RNAo RNA 浓度（》g/p l） = A260 X40X稀释倍数/10009、 加 1.5 》 l RNA 溶液于 Nanodrop 仪检测，读取 260nm 与 280nm 的吸光度数值及RNA 浓度10、 制备琼脂糖凝胶：首先将0.5g琼脂糖溶化于32ml水，冷却至60°C。

加入5X 甲醛变性凝胶电泳缓冲液10ml， 37%甲醛水溶液9ml，混合均匀并灌制胶板11、 取1p l RNA溶液，加入甲酰胺-上样缓冲液9》1, 95C变性5分钟，迅速冰浴冷却12、 150V 电泳 30 分钟，紫外灯下观察电泳结果实验结果：结果讨论：RNA 为单链分子，二级结构复杂，需先经甲酰胺变性，再进行甲醛变性琼脂糖凝胶电 泳细胞总 RNA 以 rRNA 含量最高，电泳时观察到 18S 与 28S rRNA 两条清晰条带，且亮 度之比接近 1:2，表明 RNA 没有发生降解泳道前缘还可观察到一条较为模糊且亮度较弱 的条带，主要由 5S、 5.8S rRNA 与 tRNA 组成 本小组两名成员的结果均为三条带， 说明实验结果较好实验注意事项：RNA化学性质活泼，RNA酶分布广、活性强、且难以失活，使RNA极易降解, 操作时应特别注意：以 0.1% DEPC 处理水处理实验器皿，烤干，以0.1% DEPC处理水作为所有试剂配置用水，并高压消毒，抽提RNA时，应戴手 套和口罩，少说话。