五种银杏总DNA提取方法.docx

银杏总DNA优化提取方法摘要：从5种提取DNA的方法中筛选出一种较适合银杏胚DNA的提取方法.紫外吸收 的测定结果及琼脂糖凝胶电泳分析表明，采用该法可得到完整度高、杂质少的银 杏胚DNA,且提取率高、可操作性强.关键词：银杏；DNA提取；电泳Abstract: From five extracting DNA screening method more suited to an embryo Ginkgo DNA extraction methods. UV absorption of results and agarose gel electrophoresis analysis showed that the availability of the Act integrity, Ginkgo fewer impurities embryo DNA, and high extraction rate can be workable.Key words: Ginkgo biloba,DLNA extraction,eletrophoresis银杏(Ginkgo biloba L.)是我国珍贵的经济树种，果、叶、材等用途广泛，有着较高的经济价值，尤其是其药用价值更为突出［1-2］。

银杏也称白果树，为原产我国的活化石植 物，雌雄异株由于其在科学上和经济上的意义而较多地被研究银杏目植物起源于距今 三亿多年前的古生代石炭纪，而中生代侏罗纪是银杏目植物发展的全盛时期Illi］根据化 石研究资料和品种资源调查，地球上曾经出现的银杏目植物有共有20余属150多种，现仅 存单科、单属、单种，即Ginkgo biloba L［5］银杏富含黄酮类化合物，具有抗衰老、提 高免疫机能、防治心血管病的作用［“银杏内酯具有显著的PAF拮抗作用，是公认的治疗 气管炎、哮喘斥等多种炎症的新型治疗剂［8］银杏是具有冬眠习性的落叶树，其种子在收 获后仍需经过一定时期的休眠，使种胚经过后熟作用才能萌发种子沙埋可促进后熟作用， 使之提早萌发［9-10］在后熟过程中，银杏种子代谢旺盛，种胚体积增大，呼吸作用加强随着生物技术迅速发展，探索银杏的基因资源和遗传基础常需提取其DNA由于银杏 含有多种黄酮类、银杏内酯类、酚类等复杂成分，给银杏DNA的提取带来一定的难度［if］ 我们就银杏DNA的提取方法及选材进行探索，旨在找出一种较佳的方法以获得高纯度、高 完整度的银杏总DNA，为银杏分子生物学的研究提供参考。

1 材料与方法1.1 试验材料银杏种子(均为当年种子)来自四川农业大学都江堰校区银杏园，都江堰市玉垒山，都 江堰市驾虹乡.将银杏播种于沙盆中，保持湿润，开始露白时取其胚置于-20°C冰箱中备 用洗涤缓冲液、TE溶液、十六烷三甲基溴化铵(CTAB)分离缓冲液、上样缓冲液等试剂按 文献的方法配制13］．1.2 方法1.2.1基因组DNA提取方法A具体步骤如下dm：① 把氯仿一异戊醇、无水乙醇、乙酸钠溶液、洗涤缓冲液、TE溶液置于2°C冰箱中预 冷，十六烷三甲基溴化铵（CTAB）分离缓冲液置于65 C水浴中预热② 取0.5〜lg银杏胚置于预冷的研钵中，加液氮研磨③ 把胚匀浆加到lOmlCTAB分离缓冲液的离心管中，65C水浴30min,并轻微摇动2—3 次④ 样品置于2C冰箱5min，加等体积的氯仿一异戊醇，轻微颠倒2—3次⑤ 温下 10000r / min离心20min⑥ 一开口较大的滴管将上层水相移人三角瓶，把2倍体积的无水乙醇和1/5体积的3 mol /L乙酸钠（pH值为8.0）混合液轻缓地倒人三角瓶，并轻微摇动，待出现白色沉淀后置于 -20 C 中冷冻 30min⑦ 解剖针挑出丝状DNA，转移至l0-20ml的70%的乙醇溶液洗涤10min,再用无水乙醇洗 涤两次。

⑧ DNA挑出，溶于l2ml TE中保存⑨ NA溶液置于-20 C冰箱中备用方法B、C、D、E分别在方法A的基础上个别步骤上有所改变方法B是将方法A的第一 步改为直接研磨；方法C是将方法A的第六步改为只用2倍体积无水乙醇，置于2C冰箱中 4-l0h；方法D是将方法A的第七步改为离心，使DNA沉淀，再洗涤；方法E是将方法A的第八 步改为真空抽干溶于TE中1.2.2 凝胶的制备称取3克琼脂糖，放入锥形瓶中，加入300m l的1XTBE缓冲液，置微波炉加热至完全熔 化，取去，摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液，按100m l的凝胶加5 ulEB替代品Gold View1.2.3 电泳分析取100-200ulDNA溶液混合于50-200ul电泳上样缓冲液［⑴中，上样50ul ；采用3g / L的 琼脂糖凝胶，在90-120V，40-70mA范围内电泳约2-3h，紫外灯下（波长257 nm）观察和拍照1.2.4 紫外分光光度计分析用lmg/ml的标准DNA（小牛胸腺DNA）溶液作为标准溶液，用TE溶液作为空白，分别吸 取一定量的标准DNA溶液和样品溶液，用TE溶液稀释相同倍数，测定各样品在260nm和280nm 波长处的A、A和C值.DNA提取率按公式［13］计算：260 280提取率（mg/g）=C /C XCXV/M2 1 2 2其中“C”为标准DNA的A值，“C ”为样品的A值，“C”为标准DNA浓度（lmg/ml）, “ V ”1 2 2 为样品体积， “M ”为样品鲜重。

22 结果与分析2.1不同提取方法对银杏胚DNA提取率和质量的影响在5种方法中，除方法B的DNA提取率很低外，其他4种方法的DNA提取率差异不明显（表 1）这是因为方法A、C、D、E中采用液氮研磨，而液氮能使胚组织脆化，利于细胞壁破裂, 且便于研磨充分，所以DNA提取率高方法B没有使用液氮，故提取率低.各种方法得到的 DNA样品的A /A值均在1.8左右，表明蛋白质等杂质都除得较干净［13］260 280表1不同提取方法银杏胚DNA的提取率及A260/A28 °值方法Met hodA260A280A260/A280提取率 Extraction rate/(mg/g)A0.6230.3251.9074.009B0.1050.0571.8110.625C0.6250.3221.9274.022D0.6740.3461.9294.323E0.6220.3211.9354.0022.2银杏胚DNA的琼脂糖凝胶电泳分析银杏胚DNA琼脂糖凝胶电泳结果表明，用方法A提取银杏胚DNA在琼脂糖凝胶中可见3条 清晰明亮的DNA谱带（图l,a〜f），说明方法A所获DNA的完整度高，降解小其它方法提取 银杏DNA样品，贝昭条DNA谱带不清晰，甚至仅能看到1条或2条DNA谱带（图l,g〜l）,说明所 获DNA的完整度低，降解度较大。

除了 DNA的完整度会影响DNA谱带的效果外，琼脂糖凝胶浓度高会造成DNA谱带中间拖 尾；DNA浓度太高和电流强度太弱（小于40mA），会造成DNA谱带两边拖尾；电流强度太强（大 于80mA）,DNA谱带难于分开；电泳后胶板放置一段时间（约6h以上），DNA会在未干燥的胶板 中扩散，造成DNA谱带模糊不清不同银杏品种的DNA电泳谱带相同（图2,a〜f）,由此说明用此方法不能进行品种鉴别, 但可能适于鉴定属间植物一般种间植物DNA大小相同，而属间植物DNA大小不相同Fig 1 DNA electropherograms of different extracting methoda_f：方法A； g：方法C； h：方法D； i-j：方法B； k-l:方法E；a-f： method A；g： method C；h： method D；i-j ： method B；k-l： method EM a bc d e f图2方法A提取不同品种银杏胚DNA的电泳图谱Fig 2 DNA electropherograms af different varietieswithmethodAa-c：圆子；d佛手；e：梅核；f：长子a-c； Yuanzi； d： Foshou； e： Meihe； f： Cllangzi3 讨论方法A可得到完整度高、杂质少的银杏胚DNA，且提取率高、可操作性强，可满足银杏 DNA研究的基本要求。

方法B的提取率低，应用价值不大方法C、D的提取率虽高，但方法 C的提取时间较长，而方法D使用离心沉降DNA，易导致DNA断裂，都不利于DNA分子生物学 操作方法E需用真空抽干，实验较繁锁另外，除了采用好的提取方法外，试验中还应① 在摇动水浴中的离心管及挑起DNA等步骤时应动作轻缓② 要尽量减少DNA溶液在室温中的放置时间，如研磨银杏胚、胚匀浆转移至CTAB缓冲 液中等步骤时应迅速，以防止DNA酶解在DNA提取过程中，加入氯仿一异戊醇后，振荡程度对所得DNA溶液中蛋白质含量有较 大影响［17］ 在试验中，我们发现，振荡剧烈，振荡次数多（15次以上）时，蛋白质含量多； 未振荡，仅上下轻缓颠倒2〜3次时，蛋白质含量少振荡剧烈所得上清液呈现乳白色，表 明蛋白质在盐溶液中变性析出此外，离心转速低、时间短等也可造成蛋白质含量偏高综上所述，方法A是一种快速、简便提取银杏DNA的方法，整个提取过程在1 h内即可 完成；DNA的提取率和纯度较咼；取材容易，操作简便，对设备要求不咼，可在一般实验 条件下进行参考文献:［1］ 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典(1990年版1部)［M］.北京：人民卫生出版 社、化学工业出版社，1990．89-90.［2］ 〈中国药物大全〉编委会.中国药物大全(中药卷)［M］.北京：人民卫生出版社，1988. 297.［3］ 曹福亮著.中国银杳.南京［M］；江苏科学技术出版社，2002, 12-22.［4］ 郭善基主编.银杏优良品种及其丰产栽培技术.北京［M］：中国林业出版社，1996, 1-7［5］ 陈学森，邓秀新,章文才.银杏组织培养与黄酮生产的研究I •银杏愈伤组织的诱导与褐变调控的研 究［J］.中国农业科学，1997,30(6):55-60.［6］ 李兆龙，胡季强,胡耀明•银杏叶的开发利用•上海J］:上海科学技术文献［7］ 梁立兴编著•中国当代银杏大全•北京［M］：北京农业大学出版社，1993.151〜154［8］ 吴元立，严学成.银杏成熟胚培养的细胞组织学观察［J］.林业科学，1998, 34(4):8-12.［9］ 吴元立，严学成•银杏成熟胚乳培养的细胞组织学观察［J］.果树科学，1998, 15(4):327-33.［10］ 梁红编著•应用植物学•广州［M］：广东高等教育出版社，1996.17〜18［11］ 上海植物生理学会编•植物生理学实验手册•上海［M］：上海科技出版社，1985.100〜104, 328-329.［12］ 邹琦主编.植物生理生化实验指导.北京［M］：中国农业大学出版社，1995.94〜96出版社， 1995.148-169［13］ 李建武，肖能庚，余瑞元，等.生物化学实验原理和方法［M］.北京：北京大学出版社.1994. 157, 264-289.［14］ 刘志学，陈妍珂.沙漠植物DNA快速提取方法［J］.沙漠植物，1997, 17(3)： 274-279.［15］ 房经贵，章镇•一种提取果树叶DNA的简便方法［J］.生物技术，1999, 9(2)： 31. 32.［16］ 赵妹华，王富德，张世苹，等.提取、纯化植物DNA方法的比较［J］.国外农学。