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微生物学实验论文纳豆芽孢杆菌产维生素K2的研究院 系: 论文标题: 指导老师: 姓 名:纳豆芽孢杆菌产维生素K2的研宄摘要：随着生物技术研究的不断提高，由于纳豆芽孢杆菌液体发酵产生VK2的产 量不断增加，可用液体发酵大量生产VK2同时随着医学研宂的不断深入，VK的 新药理作用将不断被人发现它对人体的营养价值和预防及治疗效果将被进一步 揭示本实验所制备的维生素K2属于MK-7构型关键词：纳豆芽孢杆菌，维生素K21前言维生素K2是一类脂溶性凝血类维生素，为甲萘醌类系列化合物，在骨质疏 松症的预防和治疗方面具有显著的效果，被称为“第四代抗骨质疏松产品”维 生素K2可以迅速改善由于维生素K缺乏引起的出血，因此几十年来维生素K2 一直被用作治疗出血的抗凝药物，并未作为人体内一种重要营养物被关注除了 作为抗凝药物外，维生素K2最显著的功能为改善骨骼和心血管健康维生素 K2是骨内多种蛋白依赖性维生素，增加成骨细胞骨钙素合成同时，骨钙素中 谷氨酸基的Y—羧基化后冰具有生物学效应，羧基化的骨钙素可与Ca和羟磷灰 石结合，使骨矿化，而这种狻基化必须有维生素K2参与1996年SatsT等[1，2] 从发酵纳豆中提取纯化到维生素K2(VK2),也称为甲基萘醌 (Menaquinout-7,MK-7)o VK2不仅参与人的凝血作用，而且在骨骼代谢中起着重要 的作用。

现代人们的饮食中，有时候缺乏的不是钙，而是维生素K2这种活性物 质，积极补充维生素K2,可使儿童的骨密度更高，骨骼更强壮，消除儿童成长 时的生长痛，对成人以后骨质疏松相关疾病有积极的预防作用维生素K2的作 用还有：(1)治疗和预防骨质疏松症，维生素K2生成骨蛋白质，再与钙共同生 成骨质，增加骨密度，防止骨折2)维生素K2可预防肝硬化进展为肝癌3) 治疗维生素K2缺乏性出血症，促进凝血酶原的形成，加速凝血，维持正常的 凝血时间4)具有利尿、强化肝脏的解毒功能，并能降低血压纳豆菌通常为(0.7-0.8) umx(2.0-3.0)um,革兰氏阳性生长在葡萄糖琼脂的细 胞原生质染色均匀芽孢椭圆形或柱状，中生或偏中生，即使孢囊膨人，也不显著，有鞭毛，能运动生长温度最高为45-55C，最低为5-20C孢子耐热性强 孢子型纳豆菌是具有耐酸、耐热特性的有益菌，在胃酸下四小时存活率为100%， 同时具有强力的病原菌抑制能力，是各种益菌当中，对环境耐受力最好可以直达小 肠的菌种之•一，UI服后可改变人体肠道菌丛生态，帮助消化道机能正常化，以使排 便顺畅，维持体内生理环保可以产酸，调节肠道菌群，增强动物细胞免疫放应。

并能生成多种蛋白酶（特别是碱性蛋白酶）、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，降解植 物性饲料中某些复杂的碳水化合物，从而提高饲料的转化率本实验通过在C源、N源以及其他生长条件（发酵培养基其他营养成分（g/L） 都适宜的情况下加以不同营养物质的消耗情况，透过实验，观察纳豆芽孢杆菌产 生维生素K2各个阶段的现象和数据，并分析原因，为日后提高生产率，提供有 效的基础数据2实验材料与方法■ ■期亞I纳S芬孢杆菌（Bacillus subtilis natto）由本实验室保藏2.2培养基及培养方法2.2. 1种子培养基中肉膏0.5%,蛋白胨1%,酵母膏0.5%, NaCI 0.5%,葡萄糖1%，pH 7.0-7.2, 121 C灭菌 30 min接种量一环，37C, 120rpm, ） 4 个 2.2.2发酵培养基廿油 5%,大豆蛋白胨（15%）,酵母粉 0.06%,K2HP040.03%，CaCl2 •2H2O 0.01%, MgSO4 • 7H2O 0.03%接种量 5%）各 5 个2.3镜检在显微镜下观察，检查种子培养液是否染菌选择未染菌的接种到发酵培养基 中，分别编为15% （1，2,3,4,5）其中5号为空白对照。

放入37C, 120rpm的摇 床培育2.4分析方法2.4.1OD值测定每隔24h测定一次OD600值，以未发酵的培养基作为对照，0D的范围在0.2〜0.8之间2.4.2甘油滴定(1) 原理以酚酞作指示剂，甘油被高碘酸钠所氧化而生成甲醛与甲酸，过量的高碘酸钠再被过量 的乙二醇还原为腆酸钠和乙二醛氢氧化钠滴定甲酸从而测定甘油含量2) 步骤取2mL发酵液于12000rpm下离心5min，移ImL上清液于250mL锥形瓶中，加蒸馏水 10mL，加两滴酚酞试剂，用0.05mol八的NaOH标准液滴定至变色，记录NaOH用U: 然 后加入10mL0.1mol/L高碘酸钠溶液，避光反应5min,再加入乙二醇(体积分数25%) 5mL， 避光反应5min然后用NaOH标准液滴定至变色，记录NaOH用量V23) 甘油含量计算用质量百分数表示：甘油含量(制92.1 X c X (V2-Vi)]/m X100%式中：VI—一空白试验所消耗氢氧化钠标准洛液的体积，mL;V2一一测定试料所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL;c 所用級氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；m 试样的质量，g;92.1——甘汕的摩尔质量g/molo2.4.4VK2的提取将10mL发酵液移入250mL带挡板的锥形瓶中，向发酵液中加入异丙醇和正己烷(1:2:4), 在摇床上220rpm振荡30min,静置分层后，取上清旋蒸，记录产物的质量，冷凝下来的正 己烷回收。

将所得的产物用异丙醇洗出，定容到10mL的棕色容呈瓶中2.4.5液相色谱检测液相条件：C18柱、流动相：100%甲醇、流速：l.OmL/min、进样量：30 u L、柱温:50C、波长:270nm3结果与讨论(1) 0D值吋间Oh24h48h72h96h0D值0.1572.9390.3110.2830.3000D值3.5Oh 24h 48h 72h 96hrfl实验结果可知，24h的实验数据误差极大，主要误差原因是没有稀释，应取0.1ml的 菌种，加入9.9ml的空白培养基，再进行OD值的测定相较于一开始的OD值,48h, 72h, 96h的数值有明显的上升2) 甘油滴定时间Oh24h48h72h96hVI2.21.80.80.90.50.30.40.350.20.3V210.79.85.75.53.64.14.14.43.753.0甘油含 量(％)3.9143.6842.2562.1181.4281.7501.7041.8651.6351.243平均值3.7692.1871.5891.7851.439甘油含量(％) 甘油含景(%)由实验结果可知，培养基中甘汕的含偏:在0h-48h逐渐减少，48h-72h上升，72h-96h含 量又减少。

24h比Oh甘汕含量减少41.97%, 48h比24h减少27.34%，72h比48h含量增加 12.33%, 96h 比 72h 减少 19.38%3) VK2的提取时间24h48h72h96h标准100VK 浓度 lmg/L2.657.9914.5315.0471.52VK 浓度 2mg/L2.8717.8117.0414.48平均值mg/L2.7612.9015.7914.7671.52VK浓度mg/L由实验结果可知,培养基中VK2的含量24h-72h增加，72h-96h减少48h比 24h 增加 363.44%，72h 比 48h 含量增加 22.40%, 96h 比 72h 减少 6.52%4结论参考文献：[1] 《维生素K2:维护骨骼和血管健康的革命性贡献》作荠：李树壮出版 社：医药科技出版社编号：1200785443.[2] 《芽孢杆菌在农业中的研究与应用》作者：杜春梅出版社：黑龙江大学 出版社书号：ISBN 978-7-81129-501-6[3] BIOTECHNOLOGY（生物技术）Vol.14 No.5 Oct.2004 作者：沙长青，杨志兴， 赵长山东北农业大学农学院，黑龙江省科学院应用微生物研宄所。

[4] 《中央民族大学学报：自然科学版》2007年第二期作者：裴凌鹏，惠伯 棣，萧福慧[5] 《生物工程进展》2001年第3期作者：王欣荣应汉杰欧阳平凯[6] 《中国食物与营养》2007年第6期作者：蒋立文;周传云;黄香华[7] 《中国药业》2008年第9期作荞：魏润新[8] 《食品科学》2008年第11期作者：李拖平;郭梅;王娜;陈积星|9|《中国医药导报》20W年第21期作者：普雯;张育;孙勇兵;刘艳;孙进;何仲贵。