Hela肿瘤细胞培养操作规程.doc

Hela肿瘤细胞培养操作规程一、实验准备1、细胞培养室的灭菌消毒细胞培养室及操作台用75%酒精擦洗3遍2、实验所需器材准备（1）移液器枪头的灭菌、烘干2）3、培养基及溶液的配制PBS溶液的配置：培养基的配置：二、细胞的复苏操作1、把冻存管从液氮或-80C冰箱中取出来后，立即37C水浴，同时轻微摇动待液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里2、把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟3、把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布4、标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到C02培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基5、3天换一次培养基三、细胞的传代1、培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代2、把原有培养基吸掉3、加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化1-2分钟4、细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化5、用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来6、把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。

7、倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来8、根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个继续培养四、冻存细胞消化下来并离心（同上）用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分把钟，写明细胞种类，冻存日期4C30min,-20C30min,-80C过夜，然后放到液氮灌中保存冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMS0.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇要注意的就是无菌操作！培养基的配制：实验步骤：在超净台内，安装好滤器用去离子水溶解1640培养基，并用磁力搅拌器搅拌2h，使之充分溶解在超净台内过滤分装到250mL的玻璃瓶内用封口膜封好，-20C保存，过滤结束时，还要取少许培养基进行菌培，验证培养基是否是无菌胎牛血清的处理：没有灭活的血清中含有补体成分，需要将血清在56C条件下灭活30min在水浴锅内进行，灭活的过程中，要不停地摇晃，使受热均匀，防止沉淀析出来注意：刚取出的冻存血清不要立即放入56C中，因为突然的温度升高会使装血清的玻璃瓶破裂，应该放在室温逐渐溶解，然后，再进行灭活处理生长培养基的配制：90mLIMDM中加入大约10mL的胎牛血清（10%左右），双抗可以不加。

有资料表明双抗对细胞有一定的毒副作用）Hanks和D-Hanks液，以及胰酶的配制Hanks液是一种常用的平衡盐溶液，D-hanks液是不含钙镁的Hanks液它们与细胞的生长状况下的pH值和渗透压一致，细胞在Hanks液中可生存几个小时，Hanks液主要用于清洗细胞D-Hanks液主要用于配制胰酶配制Hanks液需将CaCI2溶于蒸馏水，再将其它试剂配制成溶液，将两次配制的溶液混合，定容胰酶是一种常用的细胞消化液，在原代培养时，用胰酶消化，使细胞从组织块中游离出来传代培养时，用胰酶消化贴壁的细胞，并分散成单个细胞胰酶分离细胞的能力与不仅与胰酶作用的温度、时间、浓度和pH有关，还与细胞的类型和特性有关用于原代培养消化组织块采用的浓度为：0.1%或0.125%；用于传代培养采用的胰酶浓度为：0.25%或者0.2%胰酶的配制：1）由于胰蛋白酶的作用主要机制是通过螯合钙镁离子，而钙镁离子是保持细胞和细胞之间相互连接所必需的，所以，胰酶的配制用无钙镁的D-Hank液，避免钙镁离子干扰胰酶的活性2）胰酶在PH8.0时活性最强，在过滤除菌前，须用NaHC03干粉调溶液的pH值3）胰酶受热容易分解，所以避免盛夏配制，在配制过程中，温度保持在4C,最后-20C冻存。

反复冻溶会影响胰酶的活性，要分装冻存4）血清能降低胰酶的活性，所以，在终止胰酶的消化反应时，可加入含有血清的培养基[实验步骤]配制Hanks液，高压灭菌，4C保存称取胰酶，在冰浴上进行研磨，并加入少量的D-Hanks液，使其呈糊状，最后用D-Hanks定容，过滤除菌分装后，-20C保存实验三、细胞传代培养[实验步骤]1、准备工作：1）肥皂洗手，在进行无菌操作前，用75%的酒精擦拭双手，注意指间，和指甲周围同时，用酒精棉球擦拭超净台2）将培养液放置室温，备用3）打开超净台内的紫外灯，照射20min同时，将实验所需材料也放入超净台进行灭菌（血清、培养基除外）4）倒置显微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶2、关闭超净台的紫外灯，打开风机3、点燃酒精灯，取出刻度吸管，在火焰上略烧，然后，安上吸球待用4、在打开培养瓶之前，用酒精棉球擦拭瓶盖，打开后，瓶口在酒精灯上过火焰，再用吸管轻轻吸出旧的培养液，注意，吸管不要碰到布满细胞的培养瓶的侧壁5、将胰酶加入培养瓶内,显微镜下随时观察，见到细胞的突起消失，变圆时，立即翻转培养瓶，吸出胰酶记住不要消化时间过长，否则，细胞会被胰酶消化掉。

6、加入适量Hanks液或培养基清洗一遍，立即倒掉7、加入含有10%血清的培养基，用吹打管吹打，一定要轻轻吹打，使其从瓶壁上脱落分散到培养基中，再补加培养基，按1:3进行分瓶然后，用火焰烧培养瓶的瓶口和盖，再盖好培养瓶的盖，放到培养箱中进行培养以上介绍的是贴壁细胞的传代培养方法，对于悬浮细胞的传代培养方法，只需要将细胞进行离心，1000rpm,5min,然后，换入新的培养基即可再分装到不同的培养瓶中进行培养不健康的细胞质中有空泡，细胞内有颗粒样物质，细胞间空隙增大，变形，不规则，失去原有的特点4. 是否污染：传代或换液24~48h注意观察细胞是否被污染，污染的细胞培养液变浑浊，镜下可见有大量菌丝如果细胞生长缓慢，生长特性改变，胞质内颗粒性物质增多，尽管培养液不变浑浊，考虑可能有支原体污染污染的细胞立即从培养箱中取走，以免污染其它细胞实验四、细胞冻存与复苏1. [实验步骤]为了保证细胞良好的状态，在细胞冻存的前一天使细胞处于对数增长期，同时将细胞换液，次日，按照细胞传代培养方法，用胰酶消化贴壁细胞，将细胞用培养基冲下来，然后，用50mL尖底离心管离心，1000rpm,4min，弃上清，收集细胞。

2. 加入适量的冻存液（10%DMSO和90%含有20%血清的IMDM培养基）分装到冻存管中，做好标记，标明细胞名称，保存时间，所用培养基等3. 4C放置30min;-20C放置1.5h;-70C放置12h;最后移到液氮罐中细胞的复苏：细胞的复苏原则是快速溶化，因为如果缓慢的溶化，会使进入细胞的水分形成冰晶，对细胞造成伤害，因此，在复苏细胞时，将冻存细胞直接放到37C的水浴中，使其迅速溶解在超净台内将冻存管内的细胞悬浮液直接倒入小培养瓶或培养皿内，然后，加入3mL的培养液次日，观察细胞生长情况，并更换细胞培养液细胞培养是将器官、组织或细胞从生物机体中取出，模拟该器官、组织或细胞在机体内的生理条件，在体外进行培养，使其能够继续生存、生长和繁殖一.传代前准备：1. 预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37C水浴锅内预热2. 用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手3. 正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染4. 点燃酒精灯：注意火焰不能太小5. 准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒6. 取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。

7. 从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞8. 打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒胰蛋白酶消化;加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37C1. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度2. 吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液二. 吹打分散细胞：1. 吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液2. 吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中3. 平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟4. 弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。