农业微生物学实验课件.ppt

农业微生物学实验课,生命科学学院 侯春 15925157543,课程简介,训练学生的农业微生物学基本实验技能 实验内容 常见的器皿、工具和仪器设备 无菌操作技术；培养基的制备&消毒灭菌技术 土壤微生物（固氮菌）的分离培养纯化技术 微生物制片染色技术 微生物在农业上的应用实验 目的 学生掌握农业微生物学的最基本技能要求,主要参考书,沈萍，范秀容，李广武主编．微生物学实验（第三版）．北京：高等教育出版社，1999 杜连祥，路福平主编．微生物学实验技术[M]．北京：中国轻工业出版社，2005． 周德庆．微生物学实验教程（第2版）[M]．北京：高等教育出版社，2006． 杨文博主编．微生物学实验[M]．北京：化学工业出版社，2004． 赵斌，何绍江主编．微生物学实验[M]．北京：科学出版社，2002． 东秀珠，蔡妙英主编．常见细菌系统分类和鉴定方法[M]．北京：科学出版社，2001．,实验课内容介绍,农业微生物实验要求及安全须知、环境、人体表面微生物的检测 从土壤中分离各种类群微生物（重点：固氮菌的分离） 几大类群微生物个体形态观察 微生物在农业上的应用 固氮菌的分离鉴定 土壤中氨化细菌的测定 植物病原菌的分离鉴定（自主选做 ）,实验一 农业微生物学实验课 介绍与安全教育,实验课的目的,掌握农业微生物实验的最基本操作技术 相关技术得到充分训练（熟练掌握最好） 读、想、学、会、用,实验课的具体安排和要求,实验课学习要求 实验过程的要求 实验课安排 良好的实验习惯 实验报告的形式 成绩的评定及组成,实验课学习要求,认真对待，做好预习，加强自主 抛砖引玉，增强学科联系 多发现问题，多和教师交流 注重原理，努力创新 做到“读、想、学、会、用”,实验过程的要求,实验过程注意安全（具体介绍） 操作时要预防空气对流 接种时不要走动和讲话 认真做好环境卫生，做到“干干净净进来，干干净净出去” 进出实验室要洗手,实验课安排 根据教学计划，本门实验课程1.5学分，3学时/周，14周共42学时，每学时45分钟，每次课3小时；实验结果的观察是实验过程的重要内容。

分组——2-4人一组，登记联系；穿白色实验服进入实验室； 每组准备记号笔和打火机各一个； 值日生由班委每次实验前委派；,良好的实验习惯 不迟到，不缺席，有事提前请假；迟到5分钟以上以缺席计入实验习惯成绩； 爱护实验用具； 实验完成后认真清洗实验用具，并摆放整齐； 离开实验室要经教师检查同意方可离开； 认真做好值日生工作，有人具体负责安排检查实验报告的格式,实验目的 实验原理 实验材料和器材 实验方法和步骤 实验结果、数据 分析讨论及思考题,实验报告要求 1.每位学生准备规定式样的实验报告纸 2.上课时每给出一次作业，就在下一次上课前上交这一次的实验报告，不得拖延时间 3.报告要求写清楚实验目的、原理、步骤、结果及思考题希望简洁、工整 4.本门课结束前，要求使用统一的封面，把自己的所有实验报告按实验先后顺序装订成一册，交给实验教师,实验课成绩 平时成绩（20%，安排于实验过程中或 期末进行操作考核） 实验习惯（10%） 期末考试（20%，笔试考试） 实验报告（50%） 可能组织就实验内容进行答辩，替代期 末考试,实验用到仪器设备,显微镜（光学——普通、相差、微分干涉差、暗视野；电子——扫描、透射）；高压蒸汽灭菌锅（立式和卧式）；超净工作台、隔水式恒温培养箱；鼓风恒温干燥箱；恒温振荡培养箱（旋转式和往复式）；旋涡振荡器；恒温水浴锅；pH计；分光光度计（紫外、可见光、红外、原子吸收等）；离心机；冰箱；微波炉等。

实验用到器械,试管（test tube） 德汉氏小管（Durham tube） 小塑料离心管，又称Eppendorf管 玻璃吸管（glass pipette） 微量吸管（micropipette） [微量加样枪] 培养皿（petri dish） 三角烧瓶（erlenmeyer flask）,实验用到器械,载玻片（slide）和盖玻片（coverslip） 滴瓶(dropper bottle) 接种工具——接种环、接种针、接种钩、接种铲、接种刀、涂布器（玻璃或不锈钢制作）等常见的接种工具 （可根据要求自已定做）,常用玻璃仪器,实验室安全,实验教学过程中出现的各类突发事故和事件主要有： 1、火灾； 2、触电； 3、跑（漏）水； 4、化学品伤害及中毒； 5、灼伤； 6、割（划）伤实验室安全,事故处理要求 先保护好自身的安全，再施救 不要慌张，按安全预案处理 认真负责，不推缷责任 逐级上报，不隐瞒事故,化学药品及溶剂的处理方法,1.在使用强酸或强碱时必需戴上安全手套，并戴上安全眼镜 2.有机溶剂，固体化学药品，酸、碱化合物均需分类存放，挥发性之化学药品更必需放置于具有抽气装置的药品柜内 3.高挥发性或易于氧化之化学药品必需存放于冰箱或冰柜之中。

4.强酸或强碱（包括废酸碱）不得存放于金属架之上安全用电 防止事故,1.了解实验室总电源开关的安装位置 2.不可用湿手操作电器，使用电工工具前确认其完好无损 3.严禁在实验室内私自接用电源 4.确保漏电保护器起作用，用电器外壳接好地线，实验室无人时要切断电源 5.遇有电器失火，先要切断电源，再行灭火 6.人身触电，立即人工呼吸，再送医院，切忌打强心针节约用水 防止跑漏,1.不用水时，随手关闭阀门 2.废物废液不准倒在水槽内，实验完了放水冲洗水槽和下水管，勿使废液残留其中安全使用药品 防止中毒,1.使用化学药品前，要充分了解其化学性质、物理性质和使用注意事项 2.不能尝化学药品，也不能直接去闻化学药品，避免用手直接去接触药品；使用药品和实验结束后立即用肥皂水洗手 3.尽量不可在实验室进餐 4.有毒或带剌激味的实验要在通风橱内进行，实验期间要开排风扇，或开窗通风 5. 做好废液处理，防止环境污染；发现中毒现象，及时对症治疗，必要时送医院实验时需特别注意： 人身安全 防止割伤、灼伤，如有发生，应用急救药品施治,意 外 对 策,学生衣服着火的对策,以灭火「毡」包裹该同学，并使其在地上滚动 其他同学立刻通知老师。

实验室的窗帘布着火的对策：,取出灭火器，拔出安全针 把喷咀对准火源 按掣使灭火器喷出二氧化碳 其他同学立刻通知老师酒精溅在实验桌上并着火的对策：,利用沙桶或湿抹布把燃烧的液体用沙盖着 其他同学立刻通知老师学生打破了烧杯，被碎片割伤流血的对策,以清水冲洗伤口 贴上干净的消毒胶布 其他同学立刻通知老师化学药品溅进学生的眼睛内的对策,用洗眼瓶以大量清水冲洗眼睛 其他同学立刻通知老师一个学生在倾倒酸时意外地接触到酸的对策,立刻以大量清水冲洗患处最少五分钟 立刻通知老师实验物品常见警告标识符号,灭火器及其使用方法,实 验 二 实验室环境及人体表面 微生物的检测,一、目的要求 检查实验室空气中及各人手上的微生物(细菌为主)，并加以统计、比较和描述（数量、菌落形态等） 使学生认识到微生物无处不在，以便在以后的实验中重视无菌操作二、实验原理 微生物广泛分布于室内外、水、空气和土壤中； 通过对环境和人体表面微生物的检测及观察，建立起“微生物无处不在、无孔不入”的概念 形成自身良好的卫生习惯，认识到在微生物实验中无菌操作的重要性平板培养基含有微生物生长所需的营养成分，当不同来源的样品接种于培养基上，在适宜温度下培养，1~2天内每一菌体细胞即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个肉眼可见的细胞群体（菌落）； 每种微生物都有其特有的菌落形态，一般情况下一个菌落对应一个微生物活细胞，这样就可以统计不同微生物在某样品中的数量。

三、实验材料及器材,牛肉膏蛋白胨培养基平板 3个/组； 洗手液、酒精灯、记号笔、恒温培养箱等四、实验方法及步骤,（一）实验室空气中微生物检查 （二）手上微生物检测,1、取一无菌牛肉膏蛋白胨琼脂平板，打开上皿盖（皿盖扣放，开始计时），使培养基暴露于空气中30分钟，盖上皿盖 2、在37℃下倒置培养24~48小时，观察结果，统计微生物数量一）实验室空气中微生物检查 （沉降法）,3、利用沉降法测定计算空气中微生物的数量，结果的表示的方法有两种： ①一种是每一平皿上菌落形成单位; ②另一种是每一平皿实测得的菌落形成单位，再按奥梅梁斯基公式换算成为每立方米多少个细菌根据前苏联奥梅梁斯基提出的建议： 面积为100cm2的平板培养基，暴露在空气中5分钟相当于10升空气中的菌落数 具体计算公式如下：,除沉降法外，常用还有撞击式（有专门仪器设备） 多级撞击式空气微生物采样器,1、取一个牛肉膏蛋白胨琼脂平板，用记号笔在平板底部（外面）划线等分成2半，用手指在其中一半上印（或摩擦）几下（不能把培养基划破）；然后用肥皀洗手，用同一手指在另一半上印（或摩擦）几下 2、在37℃下倒置培养24~48小时，观察结果，统计比较洗手前后的微生物数量及菌落种类。

二）手上微生物检测,（三）菌落特征描写方法 ① 大小 大、中、小、针尖状可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准，或由教师指出一个大小范围 ② 颜色 黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等 ③ 干湿情况 干燥、湿润、粘稠 ④ 形态 圆形、不规则等 ⑤ 高度 扁平、隆起、凹下 ⑥ 透明程度 透明、半透明、不透明 ⑦ 边缘 整齐、不整齐,,本次实验的思考题,1、将你在平板上观察到的结果填入下表,2、计算出相应的空气中微生物数量？ 3、洗手前后的手指平板，菌落数有无区别，为什么？如果想定量测定人体某部分皮肤上的细菌如何操作？ 4、通过本次实验你有什么感受体会？ 5、根据已做过的实验，谈谈实验室安全需要注意的事项下周的实验内容,实验二 培养基配制、相关器皿的包扎及消毒灭菌 重点： 培养基的概念、分类、配制过程及注意事项； 相关器皿的规范包扎及要求； 消毒、灭菌的概念和方法，灭菌器的使用实验二 培养基配制、相关器皿的包扎及消毒灭菌,实验的目的&要求,明确培养基制备原理 通过对培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤 了解消毒、灭菌的原理及方法，掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌 学习并练习相关器皿的包扎方法,内 容 一 培养基及无菌水的制备,一、培养基的相关知识介绍,1、培养基的定义和组成 培养基：指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合营养基质（反映培养基的2个作用？）。

包括六大营养要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、能源、水2、培养基制备原则和方法,四个原则：目的明确；营养协调；物理化学条件适宜；经济节约 C/N：指在微生物培养基中所含的碳源中碳原子摩尔数与氮源中的氮原子摩尔数之比 四种方法：生态模拟；参阅文献；精心设计；试验比较,3、物理化学条件适宜的说明,pH值： 渗透压和水活度（aw）： 在同温同压下，某溶液的蒸气压（P）与纯水蒸气压（P0）之比 氧化还原电位： 针对厌氧菌分离特别需要注意（半胱氨酸、巯基乙醇酸钠等）,4、培养基的分类,（1）按成分分——对成分种类、量是否清楚 天然培养基 合成培养基（组合培养基） 半合成培养基（也称半组合培养基） （2）按物理状态分 固体培养基（凝固剂的使用1.5%-2.5%)；固体基质的使用） 半固体培养基（凝固剂使用量较低0.2-0.7%） 液体培养基（工业生产中的重要性） 脱水培养基（也称预制干燥培养基）,（3）按培养基对微生物的功能分 基础培养基：含有一般微生物生长繁殖需要的基本营养物质 选择性培养基：根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能，广泛用于菌种筛选等领域。

投其所好、取其所抗”——高通量筛选的建立 鉴别性培养基：在培养基中加入有能与目的菌的无色代产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基——直观、专一性（伊红美兰培养基，EMB）,大肠杆菌在E。