甜菜碱对细胞在高渗透压下保护作用的研究.pdf

甜菜碱对细胞在高渗透压下保护作用的研究 牵嶷，刘铭，辛艳，曹付安 ( 清华大学化学工程系，北京，1 0 0 0 8 4 ) 摘要：奉文研究了甜莱碱甘杂交瘤细胞c 5 0 生长代谢的影响，证实在高渗连压下，甜菜碱时C 5 0 细胞有走好的保护作用并确定了适于C 5 0 细胞的最佳浓度为1 0 m M ．为消除补料培养后期渗透压 过高的问题提供了一种有效的解决方法． 关t 词：甜莱碱杂变瘤细胞高渗透压 细胞对渗透压的增加相当敏感，有文献【I 表明：对大多数细胞而言，适宜的渗透压为2 6 0 一 3 2 0 m O s m ／K g ．在高渗透压下，细胞活力受到影响，最大细胞密度、比生长速率等有不同程度下 降；3 7 5 m O s m ／k g 下，细胞的生长已经略受影响：4 1 5 m O s m ／k g 下的最大细胞密度比对照下降5 0 ％ 以上；在4 5 5 m O s m ／k g 下，细胞则根本无法存活 在补料培养中，由于营养物质的加入和代谢副产物的积累，渗透压将成为进一步培养的限制 因素．这也是我们最终实现杂交瘤细胞的补料培养必须解决的问题添加细胞保护剂不失为一条 有效的途径。

文献报道口1 p 】．甜菜碱在高渗透压下对某些细胞株有一定的保护作用，但是否适用 于C 5 0 细胞．还需要具体的试验来确定 1 材料和方法 l - l 细胞系、培养条件 本文所使用的是分泌I g G 型抗C E A 单抗的鼠．鼠杂交瘤细胞C 5 0 ．由北京生物制品研究所提 供培养基采用D M E M ( G i b c 0 1 ) ．葡萄糖和谷氨酰胺的浓度分别为2 5 r a M 和4 m M ，血清含量 为5 ％( 天津川页) 试验在方瓶中进行，环境为3 7 C ，5 ％c 0 2 接种时，选择处于对数生长期 的细胞，离心弃上清，用新鲜的D M E M 培养基悬浮后接种，每批2 或3 个平行样其他成分预 先配成溶液，据需要加入．注意使加入体积小于体系总体积的5 ％ 1 ．2 各组培养基组成 A 组：标准的D M E M 培养基作空白对照，渗透压为3 3 0 m O s m ／K g B 组：在D M E M 培养基中加入1 0 r a M 甜菜碱，研究甜菜碱对代谢的影响 C 组：在D M E M 培养基中加入5 0 m M 的N a C I ，取N a + 、C l - 的渗透压系数近似为1 ，则相当 于增加了1 0 0 m O s m ／K g 的渗透压．达到4 3 0 m O s m ／K g ，然后再外加1 0 m M 的甜菜碱，研究甜菜 碱对细胞的保护作用． D 组：其体系同于B 组．但不加甜菜碱。

E 、F 、G 、H 各组均加入5 0 m M 的N a C l ，使渗透压升高到约4 3 0 m O s r a ／K g ．甜菜碱的浓度 依次为0 、5 、1 0 、1 5 m M 在细胞生长最旺盛的第4 8 小时，菩加入5 0 m M 的N a C I ，使渗透压升 高到5 3 0 m O s m ／K g ，同时每瓶中再补2 m l 的5 ％血清的D M E M 培养基 I ．3 分析方法 葡萄糖利用葡萄糖氧化酶法( 试剂盒) 分析．乳酸、铵离子分别采用三氯化铁比色法和靛酚 蓝比色法分析．细胞计数用T r y p a nB l u e 染色排除法 2 结果与讨论 2 ．1 甜菜碱对细胞生长的影响 图l 是A B C D 四组试验的细胞生长曲线从图中可以看出，甜菜碱的加入对细胞的生长几 乎没有影响，B 组细胞的最大密度、达到最大密度所需的时间以及细胞对数生长期的曲线都和空 白对照A 组一致，两者之间井无显著性差异C 组细胞的生长受到一定的抑制，生长速率降低， 活细胞的最大密度下降了2 0 ％，达最大密度的时闻滞后了约1 2 小时，对数生长期曲线中间有一 个5 - - 8 小时的“平台”，这可能是细胞对环境的一个主动适应过程。

D 组细胞( 即体系中增大 渗透压，但不加甜菜碱) 受到严重的抑制，最大细胞密度只有参比体系的2 5 ％．这与我们前面讨 论 的高渗透压对细胞有害的结论相一致 ￡ 搿 匠 V 越 帕 霎 图1 甜菜碱对细胞生长的影响 图2 显示了高渗透压下，甜菜碱对细胞物质代谢的影响情况由图可见，体系中加A 甜菜碱 以后．物质代谢曲线与参比体系物质代谢曲线几乎相同从这一点上，我们可以近似地认为，体 系中加入甜菜碱对细胞的代谢不产生影响这正是我们所需要的反之．如果体系中加入甜菜 碱后，虽然对细胞在高渗透压下起到了保护作用，而细胞自身的代谢却因此而发生了变化，则失 去了实验的原有意义了 董 匿 善 互 图2 高渗透压体系中物质代谢情况 2 ．2 甜菜碱最佳浓度的研究 图3 是不同甜菜碱浓度下细胞的生长曲线从图中可以看到，F 、G 、H 三组甜菜碱浓度下的 最大细胞密度分别为1 ．2 9 、I ．4 6 、I ．1 6 1 0 ％e l l s ，m L ．都比对照的E 组( O ．8 7 1 0 6 c e l l s ，m L ) 有显 著的提高，其中．甜菜碱浓度为1 0 m M 的G 组的最大细胞密度比对照提高了6 7 ％。

在补加N a c l 之后，体系的渗透压达到了5 3 0 m O s m ／K g ，各组细胞仍能继续生长，说明在高渗透压条件下培养 了4 8 小时之后，细胞已经适应了高渗环境 5 鹕 F 、G 、H 三组的生长曲线的趋势很接近，相形之下，1 0 m M 这组的生长情况更好一些所 以在后续的乳酸实验和补料实验中，作为保护剂的甜菜碱浓度取为1 0 r a m " 1 i m o ㈣ 图3 不同浓度甜菜碱对细胞在高渗透压下的保护作用 2 _ 3 甜菜碱在高渗透压下保护作用机理探讨 甜菜碱作为细胞保护剂的机理尚不十分的明确，通过查阅一些文献，从生物化学角度可以做 以下假设： 甜菜碱是甜菜细胞分泌的一种生物碱，对植物细胞膜有保护作用．结构式如下： 严 c H ，～4 + —c H 2 —c o o I H 从结构式看．可以认为甜菜碱是甘氨酸的衍生物，是极性分子，N 端带正电，C 端带负电 动物细胞膜与植物细胞膜结构相似，都是由双脂层作为膜的主体，脂膜上镶嵌有膜蛋白甜菜碱 分子的N 端是三个甲基和一个亚甲基，对正电荷有屏蔽作用，因而易于和膜上具有非极性基团的 氨基酸侧链和脂双层的疏水脂肪酸侧链结台：C 端亲水，在细胞膜外和水结合．这样就改变了细 胞膜的静电力。

如果外界的渗透压提高，不适合细胞生长，C 端可以吸附一部分阳离子，把渗透 压升高的部分屏蔽掉 其次，植物的抗冷性与生物膜的流动性也存在着一定的相关性，甜菜是北方作物，有可能通 过分泌甜菜碱来改变细胞膜的流动性当甜菜碱作用于动物细胞膜上．膜流动性的改变会导致膜 的通透性发生变化．使细胞抵御外界园素( p H 、渗透压等) 变化的能力增强 另外，通过查阅相关的资料．我们发现，甜菜碱的空间构型非常的独特许多的甜菜碱分子 在溶液中相互交联．形成了一个个的小的孔穴这些孔穴的大小和溶液中的离子大小相当，而且 孔穴带电这样，就有可能将溶液中游离的离子吸附到它们形成的孔穴中，故间接地减少了溶液 的离子强度故降低了溶液的渗透压 3 结论 综上所述，甜菜碱在高渗透压下对C 5 0 细胞有良好的保护作用，而且甜菜碱的加入没有对 了_叠I．o：、I)( 细胞的生长和代谢产生不利的影响．可以作为细胞保护剂使用在进行杂交瘤细胞的补料培养 时，可以考虑在初始培养基中加入少量的甜菜碱，以缓解培养过程中体系渗透压逐渐增加对细胞 的生长和代谢所带来的压力不同细胞株的最佳甜菜碱浓度可能不同，需通过试验确定．C 5 0 细 胞以1 0 m M 为佳。

参考文献 【1 】仝志明．杂交瘤细胞代谢研究及培养策略( 博士学位论文，) 1 9 9 9 【2 】K a r i n m y a a s ，e ta 1 ．B i o t e c l m o l o g ya n dB i o e n g i n e e r i n g ．1 9 9 4 ．4 3 ：7 7 8 9 【3 】K a r i n m y a a s ，e ta 1 ．B i o t e c h n o l o g ya n dB i o e n g i n e e r i n g ．1 9 9 4 ．4 4 ：9 9 t 一9 9 8 P r o t e c t i n g E f f e c to fB e t a i n eo nH y b r i d o m aC e l lC 5 0 U n d e r H y p e r o s m o t i c S t r e s s L IY a mL I UM i n g , X I Ny a n ，C A 0Z h u ’a n ( D e p a r t m e n to f C h e m i c a lE n g i n e e r i n g ，T s i n g h u aU n i v e r s i t y , B e i j i n g ，1 0 0 0 8 4 ) A b s t r a c t ：T h ee f f e c to fb e t a i n eo nt h eg r o w t ha n dm e t a b o l i s mo fh y b r i d o m ac e l lC 5 0w a si n v e s t i g a t e d ． T h er e s u l ts h o w e dt h a tu n d e rh y p e r o s m o t i cs t r e s s ，b e t a i n ep r o v i d e dg o o dp r o t e c t i o nf o rb y b r i d o m ac e l l C 5 0a n dt h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o nw a s10 m M ．T h i ss u g g e s t e da 1 1e f f e c t i v ew a yo fe l i m i n a t i n gt h e p r e s s u r eo f e l e v a t e do s m o l a l i t yi nl a t ep h a s e o f f e d - b a t c hc u l t u r e ． K e y w o r d s ：b e t a i n eb y b r i d o m ae e l lh y p e r o s m o t i cs t r e s s 5 9 1 。