双荧光报告系统.docx

报告基因Promega中文通讯 第2期2002荧光素酶双荧光素酶报告基因测试：结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时 ,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素但传统的共报告基因(比如CAT, B -Gal,GUS)不够便利，因为各自的测试化学，处理要求,检测特点存在 差异Promega提供一种先进的双报告基因技术，结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素 酶测试双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统，表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素 酶，在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速，灵敏，简便系统还提供PLB裂解液，用来裂解 在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的 研究人员双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利介绍双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测，通常一个报告基因作为内对照，使 另一个报告基因的检测均一化检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实 验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体通常实验报告基因偶联到 调控的启动子，研究调控基因的结构和生理基础。

报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动 子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照，使测 试不被实验条件变化所干扰通过这种方法，可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性，比如，培养细胞的数目和活 力的差别，细胞转染和裂解的效率使用萤火虫荧光素酶，结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), B -半乳糖苷酶(B -Gal),或葡萄醛酸 糖苷酶(GUS)的双报告基因，近几年已普遍使用但这些双报告基因组合削弱了荧光 素酶操作的 优势，比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行，但CAT, B -Gal和GUS测试法，则在定量 前需要长时间的保温另外，这些报告基因受限于它们的灵敏度和线性应答范围，必须注意不要 超过这些范围，内源性细胞活力也会干扰这类报告基因的使用许多类型的细胞有内源 B -Gal 或GUS表达，不利于准确定量报告基因表达，胞内去乙酰酶活力干扰CAT活力测试尽管在高温 下预处理细胞裂解液(1,2),会降低内源性B -Gal和CAT测试的干扰，但这些处理也会快速失活 荧光素酶因此, 在此类双报告基因检测中, 必须以不同的步骤分别处理共转染的细胞裂解液理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度,灵敏和线性范围对 同一样品中的两个报告基因同时测定。

这在传统的报告基因，如CAT, B -Gal和GUS是不可能的， 由于它们测试化学, 处理要求所固 有的局限相反 , 结合萤火虫 ( Photinus pyralis ) 和海 洋腔肠 ( Renillareniformis) 双荧光素酶， Promega 的双荧光素酶报告基因测试 (DLR) 系 统可满足这些要求，在单管中完成这些测试双荧光素酶报告基因测试化学荧火虫和海洋腔肠荧光素酶都具有生物发光报告基因的卓越的测试特点 , 但它们在进化上的 起源不同 , 因此 , 具有不同的酶学结构和底物要求这些差别用来发展了 DLR 测试化学 , 选 择性地区别这两种发光报告基因的活力萤火虫荧光素酶是一个 61kDa 单亚基蛋白质 , 酶活力 不需翻译后修饰 (3,4), 在翻译后即可作为遗传报告基因在 ATP,Mg2+ 和 O2 存在下，通过 甲虫荧光素的氧化反应发光 ( 图 1) 在常规反应条件下 , 荧光素的氧化发生时 , 以荧光素 -AMP 作为中间体 , 转换非常缓慢结果 , 在底物和酶混合后 , 测试化学产生"闪烁"的光 , 并迅速衰减专利化的测试试剂 , 定量萤火虫荧光素酶活力 , 掺入了辅酶 A(CoA), 增强快速 酶转换来提高反应动力学 (5), 导致持续的"闪烁"发光信号 ( 图 2) 。

图 1 由萤火虫和 Renilla 荧光素酶催化的生物发光海洋腔肠荧光素酶，一个 36 kDa 单亚基蛋白质，纯化自天然来源的 Renilla reniformis(6)含有 3%的碳水化合物，但是和萤火虫荧光素酶一样，酶活力不需翻译后修饰，在翻译后即可作 为遗传报告基因海洋腔肠荧光素酶所催化的发光反应，利用 O 2 和海样腔肠荧光素 （coelenterazine）（图1）当用DLR测试化学作实验时，海洋腔肠荧光素酶反应的动力学产生 闪烁型发光信号，在检测过程中缓慢地衰减（图2） 在DLR测试系统中，用单个裂解液分步测定萤火虫和海洋腔肠荧光素酶活力在完成萤火虫荧 光素酶活力（"实验"报告基因）的测定后，萤火虫发光被快速湮灭，并同时激活海洋腔肠荧光素酶 的发光反应（〃对照〃报告基因）因此，DLR测试系统整合了两个测试化学，对共表达的两个报 告基因作快速地定量，酶来自转染细胞裂解液，或无细胞转录/翻译反应萤火虫荧光素酶测试的线性范围延伸达酶浓度的8个数量级，可测定Wlfg （大约10-20摩 尔）的实验报告基因酶（图3A）用双荧光素酶报告基因测试系统，海洋腔肠荧光素酶的线性范 围达酶浓度的7个数量级，较低的底限是W 10fg （大约3X10 -19摩尔）的对照报告基因酶（图 3B），并且这两个酶的特异活力相似。

o J + e n 中 inHUt ft图2用双荧光素酶报告基因测试由萤火虫和Renilla荧光素酶产生的发光CHO细胞（1X10 6 /60mm培养板）共转染pGL3Control和pRL SV40载体DNA细胞用PBS洗涤后，加入400》l PLB制成裂解液将20p l小 量细胞裂解液和100p l荧光素酶测试试剂II（LARII）混合，萤火虫荧光素酶的活力立即用荧光 照度仪检测（细线示踪）100》 lStop&GloTM 试剂加入到荧光照度仪管中，湮灭萤火虫荧光素 酶反应，同时激活Renilla荧光素酶反应，并立即检测Renilla荧光素酶的活力（粗线示踪）Turner Designs 型号20/20荧光照度仪配有计算机用来示踪荧光发射， 12 秒内完成两次测试 双荧光素酶报告基因测试系统的方式定量两个报告基因荧光素酶的发光信号，可在制备裂解液后立刻进行， 不需将样品分成小 组分或作额外的处理因海洋腔肠和萤火虫荧光素酶均呈现闪烁型反应动力学，作双荧光素酶报 告基因测试不需要有试剂注射器的荧光照度仪通常DLR测试，大约需要30秒钟完成，如图4所说明起始萤火虫荧光素酶报告基因测试 时，将一份裂解产物和荧光素酶测试试剂II （LAR II）混合。

在完成萤火虫荧光素酶测试时，此 时萤火虫发光被湮灭，同时激活海洋腔肠荧光素酶的发光，加入 Stop & Glo TM 试剂到样品管 在 1秒钟内， Stop & Glo TM 试剂湮灭大于10 5 滴度萤火虫反应的发光信号（图 5），并同时激 活海洋腔肠荧光素酶沽佻曲虽it d *■试IOOUDlOOQwoolaaoumufsim?jnumZb萤直■tvaa图3萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶发光反应的线性范围纯化的萤火虫和Renilla荧光 素酶连续地用含lmg/ml BSA的1XPLB稀释，配有计算机的Turner Designs荧光照度仪用来检 测 10 秒钟的总荧光，在最初 2秒的预读延迟后直接检测高浓度的两种荧光素酶的发光反应时， 在荧光照度仪的样品室中加入中性密度滤光片在含10fg和lOOfg的Renilla荧光素酶反应中 测试发光，需减去来自海洋腔肠荧光素自发光的背景信号两种荧光素酶的发光活力对各自的测试变化浓度作图图 4 用手工荧光照度仪或配有试剂加样器的荧光照度仪的双荧光素酶测试方式如荧光照度仪 配有两个加样器，将裂解液预先分装到荧光照度仪的管子中，随后按序自动加入 Luciferase Assay Reagent II (LAR II) , Stop & GloTM 试剂。

PLB 裂解液PLB裂解液(Passive Lysis Buffer)，经特别设计可有效裂解培养的哺乳细胞，而不必刮下贴 壁细胞或作冻融循环尽管PLB设计应用于被动裂解过程中，但它可靠的裂解效果同样有益于使 用常规处理方法制作的裂解液无论使用何种裂解方法，对培养的哺乳细胞而言，释放到 PLB 裂解液中的萤火虫和海洋腔肠荧光素酶报告基因酶是定量和可靠的 (图6)被动裂解液的一个 明显优点，是可以抑制低水平的非酶促发光 (自发光)，这是海洋腔肠荧光素在水溶液中的固有 特点通常用来制备细胞裂解液的试剂可增强海洋腔肠荧光素自发光，包括 Triton? X-100, Promega的细胞培养裂解试？(CCLR)和报告基因裂解试剂(RLB),这些试剂还会显著抑制海洋腔 肠荧光素酶的发光反应PLB经特别设计用来最大地增强荧光素酶活力，使自发光减弱到最低，可提供最优的测试灵敏度，定量很低水平的海洋腔肠荧光素酶另外，PLB抑制发泡，非常适合高通量应用，可用于自动化系统中将培养在多孔板中的细胞组制备成裂解液并测试KJI亠arc十1W0.00Q100,00010.0001.000 tooID□ 10it*RfwwltaIN?. ftNiifih图 5 双荧光素酶报告基因测试系统湮灭萤火虫荧光素酶发光和激活 Renilla 荧光素酶发光。

CHO 细胞裂解液有共转染pGL3 -Control和pRL SV40载体DNA,按图2描述的方法制备萤火虫荧 光素酶（报告基因1）和Renilla荧光素酶（报告基因2）活力检测在10秒内完成，最初有2秒 的预读延迟为了显示Stop & Glo TM试剂湮灭报告基因1的高效率，加入等体积的Stop & Glo TM试剂（缺少海洋腔肠荧光素无法激活Renilla荧光素酶反应），萤火虫荧光素酶发光被湮灭而 又不激活Renilla荧光素酶发光在这一实验中，湮灭萤火虫荧光素酶反应的残留发光，小于未 湮灭反应值的 0.0004%CHOno，too90SO」H>CD -・主厨肿CV-1 HHa HIHJT330 ■2Q100 -图6用PLB裂解哺乳细胞的高效率和被动或主动裂解方法用pGL3-Control和pRL-SV40载体 DNA共转染图示的培养哺乳细胞，制备裂解液时，向贴壁细胞加入PLB，温和摇动培养液达15 分钟（被动细胞裂解），或从培养板中刮下贴壁细胞，在-80°C进行1次冻/融循环（主动细胞裂 解）萤火虫和Renilla荧光素酶活力用DLR方法确定，如图4所示为了便于比较，报告基因 活力用主动裂解方法对每种细胞进行归一化。

图A：萤火虫荧光素酶报告基因活力图B： Renilla 荧光素酶报告基因活力海洋腔肠荧光素酶对照载体 pRL 系列 设计的 pRL 载体系列可在哺乳动物细胞中，组成型 地 表达海洋腔肠荧光素酶这些载体含有 克隆自Renilla reniformis(7)海洋腔肠荧光素酶的cDNA (R luc )，在R luc基因中导入了 3 个碱基替换， 消除了内 Bgl II, Bam H I 和 NarI 酶切位点，这些突变不造成海洋腔肠荧光 素酶表达的氨基酸序列的改变提供的 pRL 载体有几种启动子构型，可同萤火虫荧光素酶载体组 合， 作为报告基因活力的内对照pRL-TK载体 pRL-TK (图9)，在 Rluc 上游含有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶 (HSV-TK) 的启动子区域HSV-TK 启动子在胚胎和成熟的哺乳组织细胞中，可低水平和组成型地表达(8, 9)pRL-SV40载体pR。