普通烟草脂氧合酶基因家族鉴定及表达模式分析.docx

普通烟草脂氧合酶基因家族鉴定及表达模式分析 李志远，宋青松，刘江，王德勋，范志勇，吴新儒，李晓旭，王奇，孙晋浩，郭存，晁江涛，李功博，刘贯山摘 要：脂氧合酶（LOX）是脂肪酸代谢途径的关键酶，在植物的生长发育及多种逆境胁迫响应过程中发挥重要作用本研究对烟草基因组中的LOX家族成员进行鉴定，并利用进化分析、共线性分析和表达分析等方法解析LOX家族成员的潜在生物学功能结果表明，在普通烟草中共鉴定得到18个LOX基因，其中12个LOX基因被锚定在染色体上系统进化分析表明，普通烟草中新鉴定的LOX家族成员被分为9-LOX和13-LOX两个亚家族，其中13-LOX又可被分为Type I和Type II两个亚类共线性分析表明，烟草NtLOX07、NtLOX10基因分别与拟南芥AtLOX05、AtLOX01基因形成同源基因对，并且大部分同源基因之间具有相似的表达模式表达模式分析发现，普通烟草LOX基因表达具有一定的组织特异性，并且NtLOX06等基因能够被机械损伤和茉莉酸甲脂（MeJA）处理显著诱导因此，普通烟草LOX家族成员可能在植物胁迫响应过程中发挥着重要的作用关键词：烟草;脂氧合酶;机械损伤;茉莉酸甲脂;表达模式Identification and Expression Analysis of the Lipoxygenase Gene Family in Tobacco （Nicotiana tabacum L.）LI Zhiyuan1， SONG Qingsong2， LIU Jiang3， WANG Dexun4， FAN Zhiyong4， WU Xinru1， LI Xiaoxu1，5，WANG Qi1， SUN Jinhao1， GUO Cun1， CHAO Jiangtao1， LI Gongbo1， LIU Guanshan1*（1. Key Laboratory of Tobacco Gene Resources， Institute of Tobacco Reserch of CAAS， Qingdao 266101， China; 2. Feixian Branch， Linyi Tobacco Company of Shandong， Feixian， Shandong 273400， China; 3. China Tobacco Shandong Industrial Co.， Ltd.， Jinan 250014， China; 4. Dali Branch， China Tobacco Yunnan Industrial Co.， Ltd.， Dali， Yunnan 671000， China; 5. China Tobacco Hunan Industrial Co.， Ltd.， Changsha 410007， China）Abstract： Lipoxygenase （LOX） is a key enzyme in fatty acid metabolism of plant and plays multiple roles in development and stress responses. The identification and analysis of LOX family members in tobacco can provide a theoretical basis for tobacco resistance breeding. In the current study， a total of 18 LOX family members were identified in tobacco， and 12 of those were anchored on chromosomes successfully. The phylogenetic analysis revealed that the newly identified tobacco LOX family members could be divided in 2 subgroups （9-LOX and 13-LOX）. And then， LOX members in the 13-LOX subgroup could be classified in two different types （Type I and Type II）. The syntenic analysis revealed that there were two homologous gene pairs between Arabidopsis and tobacco， and they shared similar expression patterns. Notably， the expression pattern analysis indicated that the NtLOX genes expression patterns were different in tested tissues， while several NtLOX genes could be induced by wounding and MeJA treatments， such as NtLOX06. Therefore， LOX family members in tobacco may play a significant role in the process of plant stress response.Keywords： tobacco; lipoxygenase; wounding; MeJA; expression pattern植物脂肪酸代謝途径产生的多种代谢产物在植物生长发育、抵御外界逆境胁迫和防卫反应中发挥着重要作用[1-4]。

脂肪酸代谢途径中关键基因的鉴定与分析对于解析植物胁迫响应的分子机制具有重要的意义脂氧合酶（LOX）是脂肪酸代谢途径的第一个酶也是该途径的关键酶，属于含非血红素铁的一类双加氧酶，根据其在催化反应中加氧位置的不同，脂氧合酶可分为两大类：9-LOX和13-LOX，分别在C-9（9-HPs）和C-13（13-HPs）位置引入氧原子[5-6]另一方面，根据脂氧合酶亚细胞定位结果及序列相似性可将其分为两种类型，其中不含质体转运肽并且序列相似性大于75%的为Type I型，带有假定的质体转运肽并且序列相似性在35%以上的为Type II型迄今为止，所发现的Type I型LOX均属于13-LOX[7]脂氧合酶催化形成的脂肪酸氢过氧化物（HPs）可进一步形成其他代谢产物其中一条途径是从丙二烯氧合酶（AOS）开始的，然后通过一系列酶的修饰最终形成茉莉酸（JA）[8]茉莉酸作为一种植物重要的信号分子，不仅参与生长和发育过程，还参与介导植物对食草动物和微生物病原体的防御反应[9]另一条路线则是通过氢过氧化物裂解酶（HPLs）催化脂肪酸氢过氧化物（HPs）裂解形成C6-和C12-化合物，随后生成相应的绿叶挥发物（GLVs）[10]。

绿叶挥发物被报道参与植物防御反应，诱导相关防御响应基因表达的同时也对病原菌、害虫具有直接或间接的抑制作用[11]可见，脂氧合酶在植物对外界环境的防御反应中发挥着重要作用目前，LOX基因家族成员已在拟南芥[12]、番茄[13]、猕猴桃[14]、甜瓜[15]和杨树[16]等多种植物中得到鉴定在拟南芥中共鉴定得到6个不同的脂氧合酶基因，其中AtLOX01参与叶片中病原体的防御反应[17];AtLOX02参与茉莉酸（JA）的生物合成[18];AtLOX03和AtLOX04在花发育和雄性育性调控中发挥重要作用[19];AtLOX05参与植物侧根发育和防御反应[20];AtLOX06在根中表达并参与茉莉酸（JA）的合成[21]前人在渐窄叶烟草（Nicotiana attenuata）中鉴定到3个不同的脂氧合酶基因，其中NaLOX01属于9-LOX家族，在根中特异表达[22];NaLOX02和NaLOX03属于13-LOX家族，主要在地上部的组织中表达;NaLOX02主要与绿叶挥发物的合成相关而NaLOX03则参与茉莉酸的生物合成[23-24]烟草是一种重要经济作物，由外界环境引起的生物和非生物胁迫对烟草品质及产量有重要影响。

在四倍体普通栽培烟草LOX基因家族成员的鉴定与功能研究尚未见报道为解析脂氧合酶基因在烟草生长发育和胁迫响应中的作用，本研究根据普通栽培烟草K326的基因组数据，利用比较基因组学和生物信息学手段，对烟草基因组中的脂氧合酶基因进行鉴定与分析，为阐明烟草逆境胁迫响应的分子机制和脂氧合酶家族成员的功能解析奠定基础1 材料与方法1.1 试验材料普通烟草品种K326保存并于2020年4月在烟草行业基因资源利用重点实验室内种植实时荧光定量PCR仪采用美国Applied Biosystems公司的ABI 7500型号激光共聚焦显微镜是来自德国Leica公司的TCS-SP8型号RNA提取及反转录和荧光定量试剂盒购自艾克瑞（湖南）有限公司1.2 试验方法1.2.1 烟草LOX基因家族成员的鉴定与分析 在NCBI数据库下载拟南芥（Arabidopsis thaliana）和番茄（Lycopersicon esculentum L.）、水稻（Oryza sativa L.）、大豆（Glycine max）、大麥（Hordeum vulgare L.）和渐窄叶烟草（Nicotiana attenuata）的LOX家族成员的蛋白质序列。

利用茄科基因组数据库（http：//1.2.2 系统进化分析 使用MAFFT软件对拟南芥、番茄、水稻、大豆、大麦及野生烟草LOX家族成员和新鉴定的普通烟草LOX家族成员的蛋白质序列进行多序列比对[28]基于多序列比对的结果，使用MEGA X软件采用邻接法（NJ）构建系统进化树，Bootstrap检验值设置为1000次[29]1.2.3 基因结构及保守基序分析 使用MEME工具（http：//meme.sdsc.edu/meme）检测烟草LOX家族成员的保守基序，参数设为：待检测保守基序数为15，基序长度最小为6个氨基酸，最长为50个氨基酸[30]从茄科基因组数据库（http：//solgenomics. net/）下载烟草LOX家族成员的CDS和基因组序列，并将其上传至GSDS网站（http：//gsds.cbi.pku. 1.2.4 启动子分析 截取烟草LOX基因上游2000 bp序列作为启动子区，在烟草全基因组数据库中下载启动子序列将获得的启动子序列提交至PlantCare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）网站鉴定烟草LOX基因启动子区域上存在的顺式元件[32]。

1.2.5 共线性分析 利用TBtools软件对拟南芥和普通烟草K326全基因组序列进行比对根据比对结果，利用McScan X软件分析拟南芥和普通烟草基因组之间的共线性区块，建立拟南芥和烟草之间的同源基因对，随后使用TBtools软件进行可视化展示[33-34]1.2.6 转录组数据处理及结果分析 普通烟草K326不同组织的转录组数据下载自NCBI的GEO数据库（登录号：GSE95717）[35]在转录组数据中提取烟草LOX基因在根、茎和茎尖的表达数据并进行标准化，利用T。