毕业设计与论文（烟色曲霉原生质体制备与紫外诱变）.doc

学士学位论文烟色曲霉原生质体制备与紫外诱变题目类别 毕业论文 系 别 生物工程系 专业班级 08014101 学生姓名 指导老师 老师 起止时间 2011年10月至2012年5月 论文提交时间 2012年5月 目录摘要 IV关键词 IVAbstract VKey words Vnu s 11.1材料 41.1.1 样品 41.1.2实验试剂 41.1.3 酶 41」.4仪器与设备 41.1.5培养基 41.2实验方法 51.2.1筛选育种过程 51.2.2出发菌株烟色曲霉分解壳聚糖能力检测 5123 液的配制 51.2.4他了悬液的制备 51.2.5制备原生质体 51.2.6原生质体的紫外诱变及再生 51.2.7高产菌株的检出 52结果和分析 62.1烟色曲霉原生质体制备培养条件优化 62.1.1菌龄对原生质体产率的影响 62.1.2酶液pH对原生质体产率的影响 62.1.3 IW作用温度对原生质体产率的影响 72.1.4酶作用时间对原生质体产率的影响 82.2原生质体紫外照射剂量的确定 92.3紫外诱变结果 93结论 10参考文献 11致谢 12烟色曲霉原生质体制备与紫外诱变本实验以烟色III備（Monacus fulginosus）为出发菌株，用混合酶制取原牛质体并对原牛 质体形成条件进行探讨，并进行紫外诱变选育。

采用18 h菌龄的菌丝体，使用pH为5.0的蜗 牛酶（5mg/ml） +纤维索酶（5mg/ml）复合酶液，30 °C下酶解2.5 h,在该条件下原生质体浓 度可达6.5X106个/mL,再生率为6.3%在最佳紫外线照射时间90 s下，突变株经筛选,得到一 株降解壳聚糖的酶活显著提高、遗传性能稳定的诱变株其酶活比出发菌株提高了 1.23倍关键词烟色曲霉；壳聚糖臨；原生质体；紫外诱变Protoplast Preparation and Breeding of Higher EsterifyingEnzyme Activit Mutants by Protoplast Mutagenesis ofUltraviolet Irradiation of Monacus fulginosusAbstractUsing Monacus fulginosus as the original strain,Studied on the preparation and regeneration conditions of protoplasts by mutagenesis of ultraviolet irradiation □ The results showed that treated 18h culture of Monascus ruber with 5mg/ml snail enzyme and 5mg/ml Cellulose enzyme whose pH is 5.(), the enzymolysis time was 2.5 hours, the enzymolysis temperature was 30°C, the protoplasts could reach 6.5X10 6 unit/mL, and the regeneration rate reached up to 6.3%。

Under UV iiTadiation time in the best case for the 90s, After initially sieving and duplicate sieves,the mutagenesis strain which own increasing enzyme activity and transmissibility was obtained□ Its esterifying enzyme content is 1.23 times higher than the original strain oKey wordsMonacus fulginosus; Chitosan enzymes; protoplast; ultraviolet mutagenesis刖吞原牛.质体是指细胞壁被酶水解剥离后，剩下山原牛质膜包围的原牛.质部分原牛质体通 常是由对数生长期的细胞制备|佃来的，代谢旺盛复制频繁生活力强对诱变剂的皱感性也强, 诱变后易于形成单菌落而便于筛选；同时，原生质体还具有细胞壁再生能力，保持了细胞的 全能性，可以按照常规的细胞诱变方式对其进行诱变，从而提高突变株的变异幅度，诱变效 果更为理想⑴。

1研究背景与意义H Buchman和Bonner在1959年首次报道利用酶解破壁方法从粗糙脉他霉菌丝体释放 原生质体以后，在其他各种真菌的原生质体制备和再生的研究陆续开展，极人丰富了人们对 真菌细胞外表和其生理功能的知识，尤其对于20世纪70年代中期兴起的原牛•质体融合遗传 育种手段在丝状真菌的应用起到了启动作用⑵对于朋色Illi霉的原生质体制备、再生以及原牛质体诱变育种技术的研究也FI益增多但 是自然筛选的烟色曲孫产酶水平一般较低，无商业开发价值，而诱变冇种是一种简便易行而 快速的选育方法由于各种诱变剂对微生物的作用位点和方式不尽相同，因此，反复使 丿IJ同一诱变因子会出现钝化现象可能引起微牛物的回复突变，这就耍求在烟色Illi霉进行诱变 育种吋要尽量选用新的诱变因子,才会有较大可能性取得成功原牛质体由于去除外壁障碍, 对各种诱变剂敏感性较强，往往正突变率高，因而利用原住质体直接诱变经过多种诱变剂处 理过的钝化株，是较有意义的诱变方法基于上述原因，人们采取各种手段以获得稳定性产酶菌株潘力等人2006年对酱油曲霉孑包子原牛质体的制备条件进行优化，得到酱油曲霉BI泡子 原牛质体的制备条件为：选取培养5 d、绿色抱子开始旺盛牛长的新鲜斜面培养物制备他子 悬浮液，采用25 mmol/L卩-筑基乙醉+ 5 mmol/L Na2EDTA体系预处理20 min,酶解条件是 1%溶菌酶+1%購牛酶+ 1%纤维索酶，山梨醇渗透压稳定剂(0.6 mol/L, pH 6.88),酶解温 度33 °C,酶解5h,再生培养基为0.6 mol/LNaCl高渗透压豆汁培养基，涂布法再生。

选用 致死率为99.95%以上的诱变剂量对制备的原生质体进行紫外诱变处理，最终从230余株突 变株小筛选得到7株酶活有较人提高的菌株系列U,遗传稳定性试验证明它们均具有高水平 且稳定的中性蛋白酶酶活⑶王燕2007年对双亲灭活米曲霉原生质体融合中原生质体制备的研究得岀原生质体制备 最佳条件为：最佳破壁酶为纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶3种酶混合，混合浓度比为5:3:1； 菌丝培养15 h,晦解吋加入DTT 3 nunol/L；酶解2.5 h, 0.8 mol/L NaCl作为渗稳剂，制备 所得原生质体融仑后融合率达到3.31%⑷李萍等于200()年对黑曲霉原生质体进行紫外、LiCl复合诱变，获得了 1株产卜匍萄糖 tt酶活较高的菌株，其酶活冇出发菌株的10 U/mL提高到14.7 U/mL(2]o郭鲁宏等2000年以黑曲霉(Aspergillus niger) No.13为出发菌株,经紫外线处理,获 得1株制备原牛质体的起始菌，该菌株单宁酶活性比N0.13提高55%；并对制备原牛质体的 条件进行了研究，在优化方案基础上，紫外诱变原牛质体，诱变菌株经筛选，得到1株产单 宇酶活是出发菌株的2倍的菌株⑵。

彭益强等2002年将2株黑曲霉菌株(I、II)在诱导产植酸酶的条件下分别制备成原生 质体，并考察其原生质形成及再生，经紫外诱变后，发现涂平板的黑曲每(II)原生质体在 再生过程中菌落形态发生明显变化考查突变菌种的植酸酶酶活，筛选到其中1个变界株比 原始黑曲霉(II)亲木株的植酸酶酶活提高了 2.2倍⑵2曲霉原生质体的性质2.1烟色曲霉原生质体Weibull1131^于1953年首先捉岀原牛质体概念川水解酶将细胞壁水解剥离，剩卜由原 纶质体膜包围着的原工质体部分称为原纶质体(protoplast)o其形状随不同菌类而界原生 体慕木保持原细胞结构、活性和功能，只是因为去掉了细胞壁，对渗透压和外界环境特別敏 感为制备原生质体，必须有效地除去细胞外的细胞壁去壁的方法有机械法、非酶分离法 和解法实际工作中绝大多数采用解法，时间短，效果好⑵2.2原生质体的生物学特性原生质体与完整细胞相比，细胞结构和功能是相类似的；来自不同菌丝部位的原生质体, 生理生化特性不同，对诱变剂的敏感也不同，从菌丝顶端分离出的原生质体代谢活动要强; 去壁后的原生质体対外界条件敏感，并且外界大分子如外源DNA等容易进入细胞内；原牛 质体在一•定条件卜-容易再牛成细胞壁而复原为完整细胞形态；原牛质体由于剥去了细胞壁, 等于失去了屏障，外界的因素木身对它就有影响，再加上用诱变剂诱变，对原生质体的变异 作用更强。

可以提高诱变强度，增加诱变的力度，提高高频诱变的机率，使菌株变异的幅度 大大加强，有可能从中筛选出变异特性更强、性状改变更大的菌株⑵2.3曲霉原生质体的释放过程1111霉原生质体和其他许多常见丝状真菌一样，可以从菌丝顶端和其他部位禅放，同时岀 现菌丝膨大变形，这是由于细胞壁已被水解掉，细胞膜凸岀将要成为原生质体原生质体释 放吋，通常是在菌丝体的禅放部位先膨大形成一个小球体，然后该球体逐渐增大，最后脱离 菌丝，有的还可以在原有的释放部位紧接着乂形成一•个或儿个原生质体，这可能是山于菌丝 体有关泡囊形成与细胞膜融合的机制所导致的有报道认为，在菌丝上缓慢膨大脱落的原卞 质体较为稳定，很快形成的原生质体则很脆弱释放的原生质体多呈球形，大小不一，直径为1 |_im〜20 pm,但以直彳金为5 pm〜10 jim的 中等大小的原生质体最多，其原生质体中一般含一个巨大的液泡，其余的内含物呈月牙形, 透明性较液泡羌郝勃等在相旁显微镜下详细地观察了2株黑曲霉在最适条件下形成原生 质体的过程结果表明，Illi每的原住质体均能从菌丝休的顶端及具他部位释放出來，释放的 原生质体呈球形，大小不一，大多数原生质体内均能清晰地看见含有一个巨大的液泡⑵。

2.4曲霉原生质体的制备制备原生质体是原生质体技术的而提和基础，但是不同微牛•物的细胞壁组成各不相同， 所以制备其原生质体的最佳条件也存在着很大差界早期人们曾探索使用研磨等机械方法和 超声波等物理方法来制备原生质体，制备效果都不理想，目前人们主要运用酶法来制备原生 质体对于曲霉，由于其细胞壁组成较为复杂，人们多倾向于使用复介酶进行处理，常用的 卿有纤维素陋、蜗牛酶和几丁酶等不同黑曲霉菌种在制备原生质体吋所需酶和种类不同， 而且所需陆浓度、酚解液配比、菌丝的菌龄、酶处理的温度和时间、培养方法及其他因素也 存在着差异⑵2.5烟色曲霉酶解壳聚糖的催化特性大部分壳聚糖mr内切卿，降解壳聚糖生成壳二糖、壳三糖等寡聚体的混合物，壳聚 糖酚在酶解过程中的活性是随着IV—乙酰化度、IV—取代基团及其不同取代位置以及均相和 非均相反应体系而变化的研究显示，壳聚糖酶在降解壷聚糖时，需要有一定的乙酰基协助 催化降解，在乙酰度不高的情况下，随着壳聚糖的乙酰度降低，酶的活性增高，低聚壳聚糖 的收率增人，而且降解时间是控制产物聚合度的关键因素一些研究表明，不同來源的壳聚糖陆山于其氨基酸排列顺序及分子量不同，•其催化作用 模式也不同。

Yoon等⑸对Bacillus sp.CK4产的売聚糖酶进行了定点突变研究,发现当Asp-66 改为Asp或Glu时酶活力显著下降，推测Asp-66是该酶催化活性中心所必需的氨基酸残基。