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第四章 单克隆抗体和抗体工程第四章 抗体制药第一节 概述第二节 单克隆抗体第三节 鼠源性单克隆抗体的改造第四节 基因工程抗体和抗体工程第五节 抗体诊断试剂第六节 抗体治疗药物第一节 概述一、单克隆抗体u1890年：Behring和北里柴三郎等发现了白喉抗毒素，并建立了血清疗法，开抗体制药之先河u1937年：Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种（）球蛋白、乙种（ ）球蛋白和丙种（ ）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分u20世纪60年代初期：抗原决定簇，精制单价血清单克隆抗体的应用n用于疾病的诊断和治疗：利用单克隆抗体检测与某些疾病相关的抗原，辅助临床诊断，用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，进行免疫鉴定用于临床治疗-如针对T淋巴细胞共有的分化抗原CD3的单克隆抗体，用作免疫抑制剂n单克隆抗体还可作为载体药物可对肿瘤进行定向治疗u免疫导向疗法成功障碍：（1）鼠源性单克隆抗体的免疫原性；（2）完整的抗体分子分子量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度基因工程技术n制备出改形抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等很多类型的抗体或抗体单位基本消除了单克隆抗体的鼠源性，n相对分子质量只有完整抗体分子的1/801/3，n鼠源性单克隆抗体的生物学活性如激活补体、促进吞噬功能（免疫调理）、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等，只保留同抗原特异性结合的活性。

n 抗体（antibody）：由B细胞产生的免疫蛋白，它能识别抗原的某一特定位点抗体分子由两个完全相同的重链分子以及两个完全相同的轻链组成n B细胞（B cell）：由骨髓细胞分化而来的能产生抗体的淋巴细胞n 单克隆抗体:是将抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而生产的第二节 单克隆抗体及其制备一、抗体的结构与功能n Light and heavy Chain，n 可变区（variable region），简称V区，n 3个互补决定区（complementaruty-determining region,CDR）n 重链分子上有3个恒定区constant region, C区（CH1,CH2和CH3）,n 轻链上有一个恒定区（CL）重链轻链n用木瓜蛋白酶处理，将抗体分解成3个部分 (2个Fab片段和1个 Fc片段)；nFab：一条完整的轻链和重链的可变区，轻链和重链恒定区CL和CH1之间以二硫键连接；n保存有抗原结合活性和特异性保留VH和VL即可完全获得原抗体的抗原结合活性，FvnFc：两条重链的CH2和CH3区域，二硫键连接，没有抗原接合活性，但是抗体结合上抗原后激活免疫反应的主要部位。

n 接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，在体液免疫中具有重要功能n B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡短命细胞一、杂交瘤技术产生的3个技术关键1. B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：B淋巴细胞 (B lymphocytes)：二、杂交瘤细胞系的生产骨髓瘤细胞 (myeloma cells):n 恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活长命细胞n 经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞株没有抗体分泌物2. 细胞融合技术：脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞长命不分泌抗体分泌抗体短命分泌抗体长命(Khler和Milstein, Jerne)1984年Nobel生理学及医学奖3.杂交瘤细胞的筛选脾细胞(B淋巴细胞)骨髓瘤细胞杂交瘤细胞脾细胞/脾细胞骨髓瘤细胞/骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞脾细胞筛选出不能长期存活不能长期存活次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型HAT培养基筛选原理(1)n细胞融合的选择培养基中有三种关键成分： 氨甲蝶呤(Aminopterin，A):可阻断正常的 DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑制） 次黄嘌呤(Hypoxanthine，H):是HGPRT的底物,为DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料）； 胸腺嘧啶核苷(Thymidine，T):胸苷激酶(TK)的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为DNA合成提供原料。

核苷酸合成途径-生物合成途径（D途径-主要途径）n主途径：由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程n叶酸作为重要的辅酶参与这一过程nHAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径” n辅助途径：是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成DNA，两种酶缺一不可核苷酸合成途径-生物合成途径（旁途径-S途径 ）筛选：HAT培养基筛选原理DNADNA 内源性途径(D-主要途径) ) 谷氨酰胺 or单磷酸尿苷酸二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶A AHHT T外源性途径(旁路途径) (Hypoxanthine Guznine Phosphoribosyl Transferase) 次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT )胸腺嘧啶激酶 (Thymidine kinase, TK)B淋巴细胞： HGPRT+， TK+骨髓瘤细胞： HGPRT-， TK-存活 死亡外源性途径(S-旁路途径)1、未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合nB淋巴细胞： HGPRT+， TK+n在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断n虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。

n骨髓瘤细胞HGPRT， TKn在HAT培养液中，因此自身没有“S途径”n“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡2、骨髓瘤细胞以及自身融合细胞n骨髓瘤细胞HGPRT-，TK-n既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性n在HAT培养液中，选择性存活下来，并不断增殖3、杂交瘤细胞浆细胞自发或诱发突变脾B细胞用SRBC免疫(注射X蛋白)不能在HAT培养基上生长的骨髓细胞( 带有X蛋白的抗体)细胞融合转到HAT培养基上非融合细胞死亡杂交瘤细胞生长在多孔塑料板孔内培养单个细胞(HAT培养液)培养2周杂交瘤细胞可继续繁殖优良杂交瘤细胞检测单克隆抗体接种动物,大量生产单克隆抗体细胞大量培养罐大量生产克隆抗体冷冻保藏淘汰不合格的细胞亲代死亡三、筛选阳性克隆与克隆化（1）筛选阳性克隆：n产生特定抗原的抗体产生细胞只占所有脾细胞的5%左右n筛选技术：免疫酶技术、免疫荧光技术和放射免疫技术n免疫酶技术和放射免疫技术均适用于可溶性抗原及颗粒性抗原的抗体检测n免疫荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测1、精制破伤风毒素抗原（ ）吸附（约10g/ml，4，3h）洗涤2、加杂交瘤培养上清液（ ）（4，1h）3、加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体（ ） （4，1h）洗涤洗涤4、加酶作用底物，呈色孔为阳性克隆孔ELISA用于破伤风抗体的筛选杂交瘤细胞培养细胞向培养基中分泌抗体收集培养基预先包埋好目标抗原的培养板抗原与抗体的结合EEEEE加入二抗显色说明有抗体的存在在酶的情况下,与二抗结合的分子产生特殊的颜色(ELISA)（2）克隆化有限稀释法和软琼脂法n筛选出来的阳性克隆中，可能含有不分泌抗体的细胞或有多株分泌抗体的细胞 ，而且刚刚融合获得的杂交瘤细胞不稳定，染色体容易丢失，因此应尽早克隆化。

n杂交瘤细胞要经过大约3次的克隆化，才能达到100%孔内均为抗体阳性细胞克隆n常用的克隆化方法有有限稀释法和软琼脂法n有限稀释法：是把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔细胞培养板中，使每个孔中在理论上只含有一个细胞n第一次克隆化时也要应用HT培养液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培养液n单个细胞难以存活，克隆化时也需加入饲养细胞辅助其生长n软琼脂法：在培养液中加入0.5%左右的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块n培养基是半固体状态，可用毛细吸管将小球吸出，团块打碎后，移入96孔板中继续培养n这种方法可以吸出大量克隆细胞进行培养，因初代细胞很不易增殖，所以用软琼脂法进行克隆化容易成功三、杂交瘤细胞的鉴定1）染色体鉴定:正常小鼠脾细胞的染色体数目为 40,而小鼠骨髓瘤细胞的染色体数目的变异较大，可以有6268 条染色体2）特性鉴定:对单克隆抗体的亲和力的鉴定是最重要的,一般采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法3）类别鉴定:可以用相应的抗血清及双向免疫扩散法进行鉴定 ;4）单克隆抗体的纯度鉴定:可以用有还原剂或者无还原剂条件下的 SDS- PAGE 电泳进行鉴定四、单克隆抗体的大量制备（1）体外培养法可获得10g/ml的抗体；（2）动物体内诱生法，可获得520mg/ml的抗体。

目前多采用此法生产制备单克隆抗体优点：n操作简便、比较经济、所得抗体量多、所得单克隆抗体量较多且效价亦高，n还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株，缺点：n小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度n大量培养方法：n利用悬浮培养方式可增加细胞生长空间，杂交瘤细胞生长旺盛，单克隆抗体产量得到提高n连续悬浮培养的细胞密度可达2.0107细胞/ml，收集的单克隆抗体可达到400g/ml左右n微载体悬浮培养法，增大单位体积的表面积，利于杂交瘤细胞生长，细胞密度可达108细胞/ml并能收获更多的单抗五、单克隆抗体的纯化动物体内诱生法制备单克隆抗体具体方法及过程1、澄清和沉淀处理n小鼠腹水中含有红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块及脂质等，应首先用离心力1000g离心5min，去除残留的小颗粒物质；n再用0.2m的微孔滤膜过滤，除掉污染的细菌、支原体和脂质；用饱和硫酸铵沉淀抗体，50%饱和硫酸铵能回收90%以上的单克隆抗体2、分离 主要分离方法有凝胶过滤、阴离子交换层析、亲和层析等2、分离（1）凝胶过滤（2）阴离子交换（3）亲和层析第三节 基因工程抗体及其制备(Genetic engineering antibody)基因工程抗体：根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。

主要包括：嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体一、单克隆抗体靶向制剂纤溶酶原纤溶酶原激活剂(tPA)纤溶酶血纤维蛋白原血纤维蛋白降解产物降解产物2、耦联了tPA的血纤维蛋白的单克隆抗体纤溶酶原纤溶酶抗血纤维蛋白抗体血块(1)药物与单抗直接偶联 n通过化学反应在药物分子的氨基和抗体分子的羧基之间形成酰胺键,但由于酰胺键很稳定,药物与抗体分子结合后无法释放出来,因此其药用活性几乎完全无法发挥出来n用氧化剂把药物分子上的糖基氧化成羰基,然后利用羰基与抗体分子的氨基反应形成西佛氏碱,最后还原这样制成的靶向制剂可以保留一定的药物活性,同时体外实验证明,药物显示出一定的选择性2)药物通过小分子与单抗连接n通过一些小分子交联剂,把药物分子上的某些基团与抗体分子上的某些基团连接起来3)药物通过大分子与抗体相连 n将较多的药物分子接连在一种大分子聚合物上,然后再与单克隆抗体交联二、杂交人-鼠单克隆抗体n鼠源单克隆抗体在临床上的应用前景很广,n鼠源的抗体有其局限性:被清除出人的循环系统; n鼠源抗体一般无法有效地激发宿主的免疫防卫系统,n在大多数情况下,还会引发人对于鼠源抗体本身的免疫反应, 人的抗鼠反应 (human antimouse resmse), 也就是产生人的抗鼠抗体 (human antimouse antibody, 简称 HAMA)。

Chimeric AntibodiesHuman Fc regionsMouse V regions三、人源化抗体(humanized antibody)1. 将小鼠的CDR序列移植到人抗体可变区框架中，产生的抗体称为CDR移植抗体2.将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经。