实验3.叶绿体的分离与荧光观察.ppt

实验三 叶绿体的分离与荧光观察,生命科学学院,细胞生物学实验,一、实验目的：通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法二、实验原理： 叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心可以将叶绿体分离，其分离在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠）中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤 将匀浆液在1000r/min离心，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后3000r/min离心，可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）在室温下进行分离要迅速三、实验用品：1、试剂: 0.35mol/L 氯化钠溶液0.01%吖啶橙荧光染料 2、材料: 新鲜菠菜 3、器材：150ml烧杯, 50ml 量筒 , 滴管 , 10ml 刻度离心管, 纱布若干，载片和盖玻 片4、设备：离心机、研钵、天平、普通光学显微镜、荧光显微镜1.叶绿体的分离选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除粗梗及叶脉，称取10g叶片于研钵中，先加5ml 0.35mol/L NaCl 溶液充分研磨，加至50ml，继续研磨。

将匀浆用 4层纱布过滤于150ml 烧杯中取滤液 8ml 在 1000r/min 下离心 2min，弃去沉淀将上清液在3000r/min下离心5min弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）四、实验方法与步骤：,2.叶绿体的观察将沉淀用 0.35mol/LNaCl 溶液悬浮 取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察取叶绿体悬液一滴滴载片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染液染色 1min，在荧光显微镜下观察，可见叶绿体发出桔红色荧光，细胞核则发出绿色荧光，气孔仍为绿色3.菠菜叶徒手切片观察用单面刀片将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载玻片上，滴加1～2滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖片后轻压，置于普通光镜和荧光显微镜下观察用同样的方法制片，滴加1～2滴0.01%吖啶橙染液染色1min，洗去余液，加盖片后在荧光显微镜下观察注意事项 ：1、叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤2、分离过程最好在0～4℃下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察3、离心时，离心管要平衡4、凡是荧光染料都有一定毒性，请注意保护！5、汞灯开启后15min内不要关灯，关闭后15min内不要开启。

五、实验结果与分析：,1. 简述叶绿体分离的实验原理和方法2. 在分离叶绿体时应注意哪些问题？3. 绘出菠菜叶肉细胞的形态，显示叶绿体。