蛋白质的修饰和表达.ppt

二、蛋白质功能的全新设计二、蛋白质功能的全新设计• 蛋白质设计的目标是产生既能折叠为预想的蛋白质设计的目标是产生既能折叠为预想的结构和有用的功能功能设计主要涉及键合结构和有用的功能功能设计主要涉及键合及催化及催化•为到达这些目的可以采用两条不同的途径：为到达这些目的可以采用两条不同的途径：反向实现蛋白质与工程底物的契合，改变功反向实现蛋白质与工程底物的契合，改变功能；从头设计功能蛋白质能；从头设计功能蛋白质蛋白质的功能设计蛋白质的功能设计１．通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能１．通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能２．键合及催化的从头设计２．键合及催化的从头设计３．在全新蛋白质中引入结合位点３．在全新蛋白质中引入结合位点４．催化活性蛋白质的设计４．催化活性蛋白质的设计 ５．膜蛋白及离子通道的设计５．膜蛋白及离子通道的设计 ６．新材料的设计６．新材料的设计 •蛋白质修饰的化学途径•蛋白质修饰的分子生物学途径第四章第四章 蛋白质的修饰和表达蛋白质的修饰和表达氨基的化学修饰氨基的化学修饰 •三硝基苯磺酸与赖氨酸残基反响，在420nm和367nm能够产生特定的光吸收•亚氨代乙酰基：亚氨代乙酰化反响可区分α-氨基和ε-氨基。

完全亚氨代乙酰化的蛋白质仍保持在水溶液中的可溶性•α-异硫氰酸苯酯在严格控制的条件下可对α-氨基进行相当特异性的修饰，而不作用于ε-氨基羧基的化学修饰羧基的化学修饰 •由于羧基在水溶液中的化学性知识的蛋白质分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法很有限，产物一般是酯类或酰胺类水溶性的碳化二亚胺类特定修饰羧基基团，可在较温和的条件进行 氧化和复原反响氧化和复原反响 • •二硫键的复原：二硫键的复原：2-2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等• •判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二硫键还是链间二判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二硫键还是链间二硫键的方法可用非复原硫键的方法可用非复原/ /复原双向复原双向SDS-PAGESDS-PAGE电泳技术处电泳技术处理后的蛋白很容易自动氧化，重新形成二硫键，因而需要理后的蛋白很容易自动氧化，重新形成二硫键，因而需要经过羧甲基处理，防止重新形成二硫键经过羧甲基处理，防止重新形成二硫键• •5 5，，5’ 5’二硫二硫-2--2-硝基苯甲酸〔硝基苯甲酸〔DTNBDTNB〕〔〕〔EllmanEllman试剂〕，可与试剂〕，可与巯基反响形成二硫键，使蛋白质分子上标记巯基反响形成二硫键，使蛋白质分子上标记1 1个个2-2-硝基硝基-5--5-硫苯甲酸〔硫苯甲酸〔TNBTNB〕，同时释放〕，同时释放1 1个有很强颜色的个有很强颜色的TNBTNB阴离阴离子，可在子，可在412nm412nm处通过光吸收的变化来监测反响的程度。

处通过光吸收的变化来监测反响的程度EllmanEllman是目前常用的定量测定蛋白质分子巯基数目试剂，是目前常用的定量测定蛋白质分子巯基数目试剂，还被用于探测蛋白质分子去折叠与再折叠时的构象变化状还被用于探测蛋白质分子去折叠与再折叠时的构象变化状态及跟踪构象变化的过程态及跟踪构象变化的过程 化学修饰影响的条件化学修饰影响的条件 •1、温和的反响条件是防止蛋白质分子变性的一个必要条件•2、pH值得变化：决定了具有潜在反响能力的基团所处的可反响和不可反响的离子状态•3、温度：影响活性巯基的微环境•4、有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶，但有机溶剂可使蛋白质变性•化学方法：• • 产生半合成的结构，一个天然多肽与一个人造〔或化学修饰〕的多肽相缔合• 非共价缔合• 产生二硫键• 形成肽键• 产生非天然型的共价键•非共价缔合 在多肽链中如果出现一个切口，但多肽链并不因此分开，仍能保持其生物学活性在变性系统中，破坏非共价键后，在非变性基质中仍可形成原来的构型，活力也随之恢复这一现象可用来产生半合成的类似物•产生二硫键• 二硫键被复原剂翻开，多肽彼此分开• DTT、 二硫苏糖醇• 将这些片断与适当的被修饰的或合成的另一肽相混合，通过重新形成二硫键而形成嵌合分子•形成肽键• 通过酶连接反响形成肽键• 从猪胰岛素生产人胰岛素• 将B链丙氨酸残基改为苏氨酸残基〔胰蛋白酶〕• • 通过酶法与活性酯偶联• 羟基琥珀酰亚胺酯作为接头分子•产生非天然型共价键产生非天然型共价键• 利用双功能试剂可以将不同的蛋白质连在一起。

利用双功能试剂可以将不同的蛋白质连在一起常用的方法是将双功能的接头与两个蛋白质分子常用的方法是将双功能的接头与两个蛋白质分子中的赖氨酸残基侧链相连接中的赖氨酸残基侧链相连接• 可以用主链肟键产生尾可以用主链肟键产生尾- -尾相连二聚体尾相连二聚体• 如：抗体如：抗体 制备具有不同功能的制备具有不同功能的F F〔〔ab)2ab)2的类似物的类似物•蛋白质改造的分子生物学方法 突变： 寡核苷酸介导的定向突变、 PCR方法、盒式突变 定向进化：异错PCR、基因家族改组技术•表达体系 原核表达：大肠杆菌 真核表达：酵母、昆虫、哺乳动物细胞 二、蛋白质改造的分子生物学途径二、蛋白质改造的分子生物学途径定位突变：在定位突变：在DNADNA序列中取代、插入或缺失一定长序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片断度的核苷酸片断 优点：突变率高、简单易行、重复性好优点：突变率高、简单易行、重复性好 应用：研究基因的结构与功能的关系；蛋白质结应用：研究基因的结构与功能的关系；蛋白质结构与功能，读基因调控机理、疾病的病因和机理构与功能，读基因调控机理、疾病的病因和机理方面研究方面研究 应用：寡核苷酸介导的定点突变、应用：寡核苷酸介导的定点突变、PCRPCR方法介导方法介导的定点突变及盒式突变的定点突变及盒式突变随机突变随机突变 优点：在体外模拟自然进化的过程优点：在体外模拟自然进化的过程 常用手段：易错常用手段：易错PCRPCR、基因家族改组技术〔、基因家族改组技术〔DNA DNA family shuffling)family shuffling)等等 寡核苷酸引物介导的定点突变寡核苷酸引物介导的定点突变1 1、将待突变基因克隆到突变载体上、将待突变基因克隆到突变载体上2 2、制备含突变基因的单链模板、制备含突变基因的单链模板; ;3 3、引物与模板退火，以、引物与模板退火，以5’5’端磷酸化的突变寡核苷酸端磷酸化的突变寡核苷酸引物引物, ,与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的双链的DNA,DNA,4 4、合成突变链、合成突变链: :在在DNADNA聚合酶的催化下聚合酶的催化下, ,引物以单链引物以单链DNADNA为模板合成全长的互补链为模板合成全长的互补链, ,而后由连接酶封闭缺口而后由连接酶封闭缺口, ,产生闭环的异源双链的产生闭环的异源双链的DNADNA分子分子; ;5 5、将异源双链、将异源双链DNADNA分子转化大肠杆菌后分子转化大肠杆菌后, ,产生野生型、产生野生型、突变型的同源双链突变型的同源双链DNADNA分子。

可以用限制性酶切法、分子可以用限制性酶切法、斑点杂交法和生物学方法对突变基因进行筛选斑点杂交法和生物学方法对突变基因进行筛选6 6、对突变基因序列进行分析、对突变基因序列进行分析寡核苷酸引物介导的定点突变的改进寡核苷酸引物介导的定点突变的改进缺点：产生突变效率低，原因：大肠杆菌中存在甲缺点：产生突变效率低，原因：大肠杆菌中存在甲基介导的碱基错配修复系统基介导的碱基错配修复系统改进：改进：KUNKELKUNKEL用尿嘧啶取代用尿嘧啶取代DNADNA特点特点:1:1、采用甲基修复酶缺乏的菌株作为受菌体、采用甲基修复酶缺乏的菌株作为受菌体 2 2、采用改进后的质粒，省去制备单链模板的、采用改进后的质粒，省去制备单链模板的步骤步骤 3 3、增加了多个抗生素筛选标志和相对应的多、增加了多个抗生素筛选标志和相对应的多对敲除对敲除/ /修复引物，使质粒进行屡次突变修复引物，使质粒进行屡次突变UUUUUUUUUUUUUUUUUU3’5’P模板中尿嘧啶取代胸腺嘧啶尿嘧啶-N-糖基化酶缺陷菌株 ung-dUTP酶缺陷突变体 dut- 转染ung+模板链降解Kunkel方法方法寡寡寡寡核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸引引引引物物物物介介介介导导导导的的的的定定定定点点点点突突突突变变变变的的的的改改改改进进进进关键技术步骤：制备高质量的含关键技术步骤：制备高质量的含U的单链的单链DNA模板模板 宿主：宿主：E.coli CJ 236品系品系基于抗生素抗性基于抗生素抗性“回复〞的突变方法回复〞的突变方法多克隆位点多克隆位点TetrAmpsTetrAmps突变突变氨苄青霉素抗性的阳性克隆氨苄青霉素抗性的阳性克隆设计突变体引物 氨苄青霉素抗性修复寡核苷酸PCR方法介导的定点突变方法介导的定点突变•通过改变引物中的某些碱基而改变基因序列，到达有目的改造蛋白质结构、研究蛋白质的结构和功能之间的关系的目的•取代突变、插入突变、缺失突变5’3’5’3’5’3’5’3’盒式突变盒式突变•盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片断，取代野生型基因中的相应序列，设计成粘性末端•步骤：1、将克隆片断用限制性内切酶切割2、将合成的寡核苷酸片断与酶切后的克隆片断混合3、产生突变基因产物限制性内切酶限制性内切酶目标基因中要有适当的限制性内切酶位点：利用遗传密码简并性确保盒式突变序列的正确插入方向3种方法优缺点比较种方法优缺点比较1 1、寡核苷酸引物介导的定点突变法　、寡核苷酸引物介导的定点突变法　、寡核苷酸引物介导的定点突变法　、寡核苷酸引物介导的定点突变法　 优点：保真度比优点：保真度比优点：保真度比优点：保真度比PCRPCR突变法高，改进后的突变成功率大大提突变法高，改进后的突变成功率大大提突变法高，改进后的突变成功率大大提突变法高，改进后的突变成功率大大提高高高高 缺点：操作过程复杂、周期长，待突变位点会受到限制性酶缺点：操作过程复杂、周期长，待突变位点会受到限制性酶缺点：操作过程复杂、周期长，待突变位点会受到限制性酶缺点：操作过程复杂、周期长，待突变位点会受到限制性酶切位点限制切位点限制切位点限制切位点限制2 2、、、、PCRPCR方法方法方法方法优点：操作简单，突变成功功率达优点：操作简单，突变成功功率达优点：操作简单，突变成功功率达优点：操作简单，突变成功功率达100%100%。

缺点：后续工作复杂，要与载体相连；缺点：后续工作复杂，要与载体相连；缺点：后续工作复杂，要与载体相连；缺点：后续工作复杂，要与载体相连；TaqDNATaqDNA聚合酶保真聚合酶保真聚合酶保真聚合酶保真性低，要分析学列性低，要分析学列性低，要分析学列性低，要分析学列3 3、盒式突变、盒式突变、盒式突变、盒式突变优点：简单、突变效率高优点：简单、突变效率高优点：简单、突变效率高优点：简单、突变效率高缺点：合成多条引物的本钱较高缺点：合成多条引物的本钱较高缺点：合成多条引物的本钱较高缺点：合成多条引物的本钱较高蛋白质定向进化蛋白质定向进化•19931993年，美国科学家年，美国科学家Arnold Fh Arnold Fh 首先提首先提出酶分子的定向进化的概念出酶分子的定向进化的概念易错易错PCR技术为代表的无性进化技术为代表的无性进化DNA shuffling为代表的有性进化为代表的有性进化定向进化技术定向进化技术•人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本蛋白质〔天然的或者人为获得的〕出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化蛋白质定向进化的原理•易错PCR技术(error-prone PCR)•DNA改组(DNA shuflling)：由美国Stemmer 于1994 年首次提出 一项体外重组技术•随机引发重组(RPR) 1998 年, Arnold 提出了一种有效的新方法•交错延伸技术(StEP)：由Zhao 等 提出, 是一种简化的DNA shuffling 技术 随机突变的策略•易错 PCR〔error prone PCR〕是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变•连续易错PCR (sequential error prone PCR)策略。

即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变易错PCRDNA改组和外显子改组Ø DNA改组(DNA shuffling)又称有性PCR (sexual PCR)，原理如下图Ø 外显子改组(exon shuffling类似于DNA改组，与但与其不同，它是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上体外随机引发重组体外随机引发重组 体外随机引发重组体外随机引发重组(random (random priming in vitro recombination, priming in vitro recombination, RPR)RPR)以单链以单链DNADNA为模板，配为模板，配合一套随机序列引物，先产生合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短大量互补于模板不同位点的短DNADNA片段，由于碱基的错配和片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短错误引发，这些短DNADNA片段中片段中也会有少量的点突变，在随后也会有少量的点突变，在随后的的PCRPCR反响中，它们互为引物反响中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度成完整的基因长度交错延伸 交错延伸交错延伸(stagger (stagger extension process, StEP) extension process, StEP) 在在PCRPCR反响中把常规的反响中把常规的退火和延伸合并为一步退火和延伸合并为一步, , 缩短其反响时间，从而缩短其反响时间，从而只能合成出非常短的新只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火时存在的不同模板退火而继续延伸。

此过程反而继续延伸此过程反复进行，直到产生完整复进行，直到产生完整的基因长度的基因长度定向进化的筛选策略突变体别离•琼脂板涂布法琼脂板涂布法 在特殊条件下培养突变菌，通过宿在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反响的出现等主菌的生长情况、培养基颜色、特定反响的出现等判断是否具有目的基因判断是否具有目的基因•微孔板悬浮法微孔板悬浮法 在含生色底物平板上培养，挑取具在含生色底物平板上培养，挑取具有活性的克隆接种到有活性的克隆接种到9696孔板上检测吸光度使用微孔板上检测吸光度使用微流控芯片流控芯片•微球细胞固定法微球细胞固定法 与数字成像系统结合，将单个细胞与数字成像系统结合，将单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行别离和筛选附着在单个固体珠上，突变体进行别离和筛选•流式细胞计数法流式细胞计数法 细胞经荧光染色后，通过高速流动细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细胞计数仪进行测系统，排成单行，逐个通过流式细胞计数仪进行测定定ØØ通过酶促反响的特征通过酶促反响的特征ØØ参加底物显色参加底物显色ØØ荧光共振能量转移荧光共振能量转移ØØ同位素标记底物同位素标记底物ØØ通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测酶检测信号探测ØØ分光光度计和荧光酶标仪分光光度计和荧光酶标仪ØØ气相色谱和高效液相色谱气相色谱和高效液相色谱ØØ质谱和核磁质谱和核磁定向进化与自然进化的异同点ØØ定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。

和应用ØØ定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化，定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化，使进化朝着人们需要的方向开展使进化朝着人们需要的方向开展ØØ两者的不同：两者的不同：•进化动力不同： 保守突变 非保守取代；•进化方向不同： 适应突变的积累； •进化速度不同： 非常漫长 只需几年、甚至几天； • 进化目标不同： 适应环境 超越生物学意义的要 求，探索所希望的蛋白质在顺序空间的可及性 定向进化技术Fig. 1. Publication rate of the ‘directed evolution’ articles in biomedical literature between 1995 and 2004. The analysis was achieved using the National Institutes of Health MEDLINE bibliographic database. The figure shows the total number of articles published each year, which contain the key words ‘directed evolution’ in their titles.目标酶目标酶所需功能所需功能方法方法结果结果实施菌种实施菌种卡那霉素核苷基卡那霉素核苷基转移酶转移酶热稳定性热稳定性定位诱变定位诱变+ +选择选择在在60-50℃60-50℃酶半衰期酶半衰期增加增加200200倍倍耐热脂肪耐热脂肪芽孢杆菌芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶作用于有机溶作用于有机溶剂剂易错易错PCR+PCR+选择选择在在6060％二甲基亚砜主％二甲基亚砜主仆女冠活力增强仆女冠活力增强170170倍倍枯草杆菌枯草杆菌β-β-内酰胺酶内酰胺酶作用于新底物作用于新底物DNADNA改组改组+ +选择选择对对cefotaximecefotaxime的抗性的抗性增加增加3200032000倍倍大肠杆菌大肠杆菌对硝基苯酯酶对硝基苯酯酶有机溶剂中的有机溶剂中的底物特异性和底物特异性和活性活性易错易错PCR+PCR+重组重组活力增加活力增加60-15060-150倍倍大肠杆菌大肠杆菌胸苷激酶胸苷激酶第五特异性第五特异性 基基因理疗因理疗交错延伸交错延伸+ +选择选择活力增加活力增加4343倍倍大肠杆菌大肠杆菌β-β-半乳糖苷酶半乳糖苷酶底物特异性底物特异性DNADNA改组改组+ +选择选择活力增加活力增加6666倍底物特倍底物特异性增加异性增加10001000倍倍大肠杆菌大肠杆菌砷酸脱毒途径砷酸脱毒途径砷酸抗性砷酸抗性DNADNA改组改组+ +选择选择抗性增加抗性增加1212倍倍大肠杆菌大肠杆菌定向进化的应用定向进化的应用§改进的易错PCR方法：§MgCl2浓度增加到7mmol/L稳定非互补的碱基对；§参加0.5mmol/L MnCl2降低聚合酶的特异性；§dCTP和dTTP的浓度增加到1mmol/L促进错误掺入；§Taq DNA聚合酶量增加到5U以促进延伸链在碱基错配位置后得以继续。

Figure 1 The routine of stagger extension process结果产生间隔含不同模板序列的新生DNA分子Figure 11 Strategy of the construction of the recombinant Figure 12 Strategy of selection of the recombinant plasmid 基因融合基因融合•防止外源蛋白的快速降解：小肽防止外源蛋白的快速降解：小肽•使表达产物快速、有效的回收和纯化：分泌使表达产物快速、有效的回收和纯化：分泌- -亲和亲和融合、双亲和融合法、分泌融合、双亲和融合法、分泌- -插入融合法插入融合法•定向分泌：信号肽定向分泌：信号肽•体外切割：体外切割：•改变外源蛋白的溶解性，防止包涵体的形成：与改变外源蛋白的溶解性，防止包涵体的形成：与硫氧化复原蛋白形成融合体硫氧化复原蛋白形成融合体•研究蛋白质结构功能研究蛋白质结构功能融合基因的构建的方法融合基因的构建的方法•PCR方法•蛋白质内含肽接到的蛋白质分子的连接 目标蛋白或蛋白片段用pCYB作为表达载体进行连接，产生目标蛋白-蛋白内含肽-甲壳素结合蛋白结构域的融合蛋白。

此蛋白与苯硫酚及合成肽一起融合，形成融合肽载体为pCYB 载体为pCYB 载体为pCYB ，形成蛋白内含子-甲壳素结合蛋白结构域的融合蛋白 tRNA接到的非天然氨基酸掺入接到的非天然氨基酸掺入•4.14.1将目标蛋白质的基因重组入可用于体外转录的将目标蛋白质的基因重组入可用于体外转录的载体中载体中•4.2 4.2 利用寡核苷酸介导的位点特异性突变，将特定利用寡核苷酸介导的位点特异性突变，将特定氨基酸的密码子突变为无义密码〔氨基酸的密码子突变为无义密码〔TAGTAG〕〕•4.3 4.3 利用利用run offrun off转录或化学转录或化学/ /酶法反密码子环取代法酶法反密码子环取代法合成相应的校正合成相应的校正tRNAtRNA，将氨基酸连接在校正，将氨基酸连接在校正tRNAtRNA上上•4.4 4.4 通过体外转录体系，产生在特定位点突变成通过体外转录体系，产生在特定位点突变成UAGUAG的的mRNAmRNA，，•4.5 4.5 通过体外反以体系，将非天然氨基酸掺入到蛋通过体外反以体系，将非天然氨基酸掺入到蛋白质分子中的特定位点白质分子中的特定位点外源蛋白表达体系外源蛋白表达体系•原核表达体系：大肠杆菌•真核表达体系：酵母、昆虫、哺乳动物原核表达体系原核表达体系•是外源基因表达的首选体系，只有在大肠杆菌中是外源基因表达的首选体系，只有在大肠杆菌中的表达产物由于不能正确折叠或缺少翻译后修饰的表达产物由于不能正确折叠或缺少翻译后修饰而没有生物活性，或当天然蛋白质的回收率太低而没有生物活性，或当天然蛋白质的回收率太低时，才考虑选择其它表达体系。

时，才考虑选择其它表达体系•优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养，高优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养，高密度发酵；密度发酵；•缺点：缺点： ①①没有真核转录后加工的功能没有真核转录后加工的功能 •②②没有真核翻译后加工的功能没有真核翻译后加工的功能 •③③表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集成包涵体成包涵体 • •如何改善外源蛋白的溶解性？如何改善外源蛋白的溶解性？如何改善外源蛋白的溶解性？如何改善外源蛋白的溶解性？• •外源蛋白的分泌表达外源蛋白的分泌表达外源蛋白的分泌表达外源蛋白的分泌表达• •细菌生长温度：改善在细胞质中表达蛋白溶解性的最简单细菌生长温度：改善在细胞质中表达蛋白溶解性的最简单细菌生长温度：改善在细胞质中表达蛋白溶解性的最简单细菌生长温度：改善在细胞质中表达蛋白溶解性的最简单方法是在诱导过程中降低工程菌的生长温度〔降低到方法是在诱导过程中降低工程菌的生长温度〔降低到方法是在诱导过程中降低工程菌的生长温度〔降低到方法是在诱导过程中降低工程菌的生长温度〔降低到3030度度度度或更低〕；通过用较弱的启动子减慢蛋白合成速率或利用或更低〕；通过用较弱的启动子减慢蛋白合成速率或利用或更低〕；通过用较弱的启动子减慢蛋白合成速率或利用或更低〕；通过用较弱的启动子减慢蛋白合成速率或利用局部诱导条件也可防止蛋白的错折叠和聚集，而使大量可局部诱导条件也可防止蛋白的错折叠和聚集，而使大量可局部诱导条件也可防止蛋白的错折叠和聚集，而使大量可局部诱导条件也可防止蛋白的错折叠和聚集，而使大量可溶蛋白积累。

溶蛋白积累溶蛋白积累溶蛋白积累• •外源蛋白与分子伴侣和折叠酶共表达外源蛋白与分子伴侣和折叠酶共表达外源蛋白与分子伴侣和折叠酶共表达外源蛋白与分子伴侣和折叠酶共表达• •外源蛋白与相关蛋白或蛋白标签融合：如与硫氧环蛋白、外源蛋白与相关蛋白或蛋白标签融合：如与硫氧环蛋白、外源蛋白与相关蛋白或蛋白标签融合：如与硫氧环蛋白、外源蛋白与相关蛋白或蛋白标签融合：如与硫氧环蛋白、His6His6标签等功表达可以增加外源蛋白的溶解性标签等功表达可以增加外源蛋白的溶解性标签等功表达可以增加外源蛋白的溶解性标签等功表达可以增加外源蛋白的溶解性 酵母表达体系酵母表达体系 •表达载体：Yep〔酵母附加体质粒〕和YCp〔酵母着丝点质粒〕，二者都含有促进在酵母中自主复制的序列，或ARS序列元件是多拷贝质粒 •甲醇酵母系统 •外源蛋白质在酵母细胞中可以在蛋白质二硫键异构酶的作用下形成正确的二硫键在酵母细胞中可以产生N-和O-连接的糖基化，从而糖组分与蛋白质分子共价相连•哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。

• •哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染体的感染 • •病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内常用的病毒细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semlikisemliki森林病森林病毒毒(sFv)(sFv)载体等• •质粒载体那么是借助于物理或化学的作用导人细胞内依质粒载体那么是借助于物理或化学的作用导人细胞内依据质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载据质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体分为整合型和附加体型载体两类整合型载体无复制能体分为整合型和附加体型载体两类整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在而附加体型力，需整合于宿主细胞染色体内方能稳定存在而附加体型载体那么是在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式载体那么是在细胞内以染色体外可自我复制的附加体形式存在整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因存在。

整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的的表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长特性生长特性 表达载体的表达表达载体的表达 • •①①原核原核DNADNA序列，包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子，序列，包括能在大肠杆菌中自身复制的复制子，便于筛选含萤组细菌的抗生素抗性基躅，以及便于目的基便于筛选含萤组细菌的抗生素抗性基躅，以及便于目的基因插入的限制性酶切位点目前采州的哺乳动物细胞表达因插入的限制性酶切位点目前采州的哺乳动物细胞表达戟体大都带有来自戟体大都带有来自pBR322pBR322的衍生质粒如的衍生质粒如pX[3pX[3、、pBRdpBRd和和pMpM[ [的原核序列；的原核序列；• •②②启动子和增强子；启动子和增强子；• •③③剪接信号；剪接信号；• •④④终止信号和终止信号和poIyApoIyA加尾信号加尾信号 • •遗传选择标记遗传选择标记 ：胸腺激酶：胸腺激酶(tk)(tk)基因、二氢叶酸复原酶基因、二氢叶酸复原酶(dh]r)(dh]r)基因、新霉素基因、新霉素(neo)(neo)抗性基因、氯霉素乙酰基转移抗性基因、氯霉素乙酰基转移酶酶(cat)(cat)基因等基因等dhfrdhfr还可作为共扩增基因使外源基因的表达还可作为共扩增基因使外源基因的表达产物增加产物增加 宿主细胞宿主细胞 •常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢常用的非淋巴细胞类有中国仓鼠卵巢(CHO)(CHO)细胞、细胞、小仓鼠肾小仓鼠肾(BHK)(BHK)细胞、细胞、COSCOS细胞、小鼠细胞、小鼠NSONSO胸腺瘤胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0SP2/0细胞等细胞等 •CHOCHO细胞那么利于外源基因的稳定整合，易于大细胞那么利于外源基因的稳定整合，易于大规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生产，是规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生产，是用于真核生物基因表达软为成功的宿主细胞。

已用于真核生物基因表达软为成功的宿主细胞已用于多种复杂的重组蛋白的生产，但其产量较低，用于多种复杂的重组蛋白的生产，但其产量较低，一般仅占细胞蛋白的一般仅占细胞蛋白的2.5% 2.5% • 降低外源多肽降解的策略•用蛋白酶缺失的菌株作为受体菌；形成融合体；改变生长条件：饥饿时可引起蛋白质周转率提高，低温降低蛋白水解，酸性条件抑制外泌蛋白降解〔Ph5.5-6〕。