淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术.docx

淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术1975 年， Kohler 和 Milstein 发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小 鼠脾细胞进行融合， 形成的杂交细胞既可产生抗体， 又可无限增殖， 从而创立了 单克隆抗体杂交瘤技术 这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了 新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤 细胞的克隆化、 冻存以及单克隆抗体的大量生产， 要经过几个月的一系列实验步 骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法一、细胞融合前准备（ 一 ） 免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的 McAb至关重 要一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫， 免疫方案应根据抗 原的特性不同而定1. 颗粒性抗原免疫性较强， 不加佐剂就可获得很好的免疫效果 下面以细 胞性抗原为例的免疫方案 :初次免疫1X 10 7/ 0.5ml ip ( 腹腔内注射）第二次免疫1X 107/ 0.5ml ip加强免疫 （融合前三天 ）1X 107/ 0.5ml ip 或 iv( 静脉内注射 ）取脾融合2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福 氏不完全佐剂。

要求抗原和佐剂等体积混合在一起， 研磨成油包水的乳糜状， 放 一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态 商品化福氏完全 佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀初次免疫 Ag 1〜50卩g加福氏完全佐剂皮下多点注射I （一般 0.8 〜1ml 0.2ml /点）J 3周后第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或 ipI （ip剂量不宜超过0.5ml）J 3周后第三次免疫 剂量同上，不加佐剂， ipI （5〜7天后采血测其效价，检测免疫效果）J 2〜3周后加强免疫，剂量50〜500卩g为宜，ip或iv；3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原 （特别是一些弱抗原 ） 的免疫方案也不断有所更新， 如 ①将可溶性抗原颗粒化或固相化， 一方面增强了抗原的免疫原性， 另一方面可降 低抗原的使用量 ②改变抗原注入的途径， 基础免疫可直接采用脾内注射 ③使 用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性 二 ） 饲养细胞在制备单克隆抗体过程中， 许多环节需要加饲养细胞， 如：在杂交瘤细胞筛 选、克隆化和扩大培养过程中， 加入饲养细胞是十分必要的 常用的饲养细胞有： 小鼠腹腔巨噬细胞 （较为常用 ） 、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞， 也有人用小鼠成 纤维细胞系 3T3 经放射线照射后作为饲养细胞， 使用比较方便， 照射后可放入液 氮罐长期保存，随用随复苏。

小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用 BaLb/c小鼠6〜10周龄拉颈处死 浸泡于75%酒精，消毒3〜5分钟用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜用无菌注射器注入 6〜8ml 培养液反复冲洗，吸出冲洗液放入 10ml 离心管， 1200转/分离心 5〜6分钟用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数1X 105/ ml加入96孔板，100卩l /孔放入37r CO孵箱培养一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5〜8X 106腹腔巨噬细胞， 若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为 5X 106/ ml,小鼠脾细胞为1X 106/ml，小鼠的成纤维细胞（3T3）1 X 105/ml,均为100卩l /孔 三） 骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系， 这样杂交融合率高， 也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量 McAb常用骨髓瘤细胞系有： NS1、SP2／0、X63 Ag8.653 等骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如 RPMI1640 DME培养基小牛 血清的浓度一般在10〜20%,细胞的最大密度不得超10 6/ ml, —般扩大培养 以1 : 10稀释传代，每3〜5天传代一次。

细胞的倍增时间为16〜20小时，上述 三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长， 只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细 胞一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对 HAT 的敏感性，每3〜6月应用8〜AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于 95%，也是决定细胞融合的关键 四) 免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中 B淋巴母细胞棗浆母细胞一般取最 后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例 较大，融合的成功率较高脾细胞悬液的制备： 在无菌条件下取出脾脏， 用不完全的培养液洗一次， 置 平皿中不锈钢筛网上， 用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数 一般免疫后脾脏体 积约是正常鼠脾脏体积的2倍，细胞数为2X 10 8左右细胞融合，选择杂交瘤( 一 ) 细胞融合流程(1) 取对数生长的骨髓瘤细胞 SP2/0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用 不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤 2次2) 同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤 2 次3) 将骨髓瘤细胞与脾细胞按1 : 10或1 ：5的比例混合在一起，在50ml 塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。

4) 弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响 PEG勺浓度5) 轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动6) 在室温下融合 :① 30秒内加入预热的1ml45% PEG(Merek,分子量4000)含5% DMSO边加 边搅拌② 作用 90 秒钟，若冬天室温较低时可延长至 120 秒钟③ 加预热的不完全培养液，终止PEG乍用，每隔2分钟分别加入1ml, 2m l ， 3ml， 4ml， 5ml 和 10ml7) 离心， 800rpm， 6 分钟8) 弃上清，先用6ml左右20%小牛血清RPMI1640S轻混悬，切记不能 用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开9) 根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml 一块96孔板10) 将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的 96孔板，100卩l /孔，37C、 5% CO孵箱培养一般一块96孔板含有1 X 107脾细胞二)HAT选择杂交瘤应用 HAT 选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题 中已经提到，这里主要介绍加 HAT选择培养的时间和浓度一般在融合24小时后，加HAT选择培养液HT和HAT均有商品化试剂50 X贮存，用时1ml加入50ml20%小牛血清完全培养液中。

因为在培养板内已加入饲养细胞、 融合后的细胞，200卩l /孔所以在加选 择培养液时应加3倍量的HAT我们认为，融合后最初补加的量可用全量的 2/3 进行选择，可得到满意的筛选结果50X HATH: 5X 10-3MA: 2X 10- MT: 8X 10-4M一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用 HT培养液，再维持培养两 周，改用一般培养液三、抗体的检测筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中， 仅少数能分泌针对免 疫原的特异性抗体 一般在杂交瘤细胞布满孔底 1 ／ 1 0面积时，即可开始检测特 异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系检测抗体的方法应根据抗原的性质、 抗体的类型不同， 选择不同的筛选方法， 一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则常用的方法有 :1. ELISA用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等McAb的检测2. RIA用于可溶性抗原、细胞 McAb的检测3. FACS荧光激活细胞分类仪）用于检查细胞表面抗原的McAb检测4. IFA用于细胞和病毒McAb的检测上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。

四、杂交瘤的克隆化和冻存克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化 犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤 克隆不能保证一个孔内只有一个克隆 在实际工作中， 可能会有数个甚至更多的 克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体 （特异性抗体 ） 分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化 克隆化的原则是， 对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化， 否则抗体分 泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制， 因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体 分泌的细胞生长速度快， 二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失 即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失， 从而丧失产生抗体的能力 一 ） 克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法1. 有限稀释法的程序① 制备饲养细胞悬液 （ 同融合前准备 ）② 阳性孔细胞的计数，并调细胞数在 1〜5X10 3/ ml③ 取 130 个细胞放入 6.5ml 含饲养细胞完全培养液， 即 20个细胞／ ml， 1 00卩l /孔加A B C三排为每孔2个细胞余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含 饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个/ ml，100卩l /孔加D E、F三排，为每 孔 1 个细胞。

余下 2.2ml 细胞悬液补加 2.2ml 含饲养细胞的完全培养液， 细胞数 5个/ml, 100卩l /孔，加G H两排，为每孔0.5个细胞④ 培养 4〜5 天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养 液200卩l /孔⑤ 第 8〜 9 天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测注: 初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加 HT2. 软琼脂法① 软琼脂的配制含20% FCS小牛血清）的2倍浓缩的RPMI16401 %琼脂水溶液：高压灭菌，42 E预热0.5 %琼脂： 由 1 份 1%琼脂加 1 份含 20%小牛血清的 2 倍浓缩的 RPMI1640 配制而成置42 C保温② 用上述0.5 %琼脂液（含有饲养细胞）15ml倾注于直径为9cm的平皿中， 在室温中待凝固后作为基底层备用③ 按 100/ml， 500/ml 或 5000/ml 等浓度配制需克隆的细胞悬液④ 1ml 0.5 %琼脂液（42 C预热）在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液 相混合⑤ 混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中 1 0分钟，使其凝固，孵育 于37C, 5%CO孵箱中⑥ 4〜5天后即可见针尖大小白色克隆，7〜10天后，直接移种至含饲养细 胞的 24 孔板中进行培养。

⑦ 检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化 二） 杂交瘤细胞的冻存及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要 的因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候， 细胞的培养过程中随时 可能发生细胞的污染、 分泌抗体能力的丧失等等 如果没有原始细胞的冻存， 则 因为上述的意外而全功尽弃杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样， 原则上细胞应在每支 安瓿含1X 106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变， 在24 孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿细胞冻存液 :50%小牛血清40%不完全培养液10% DMSO二甲亚砜）冻存液最好预。