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德国 Nano Temper ---最新的分子间相互作用分析仪 MST 最新的分子间相互作用分析技术平台 快速、无需固定、低样品量、天然溶液、高灵敏度 技术优势： ☆ 快速：在 10 分钟之类测量解离常数 ☆ 高灵敏范围：从离子和片段结合到复合物间作用 ☆ 天然的环境条件：直接在血清和裂解液中测量 ☆ 样品使用量低：nM 的浓度下只需<4ul 样品量 ☆ 溶液测量：不需要固定到固相表面 ☆ 动力学范围：亚-nM 和 mM 的解离常数 ☆ 极低消耗费、无维护费、简单易操作 工作原理： 微量热泳（MST）是一种分析生物分子的技术微尺度热泳是粒子在微观的温度梯度中的定向运动生物分子结构/构象的变化引起的水化层的变化导致的沿温度梯度运动的相对变化可以用来确定亲和力甚至像蛋白质磷酸化或小分子结合到靶标上都可以被监测MST 也允许直接在溶液中测量分子间相互作用，而不需要一个固定的表面（无需固定）MST 是由总部设在慕尼黑的德国高科技公司 NanoTemper 技术有限公司发展出来的 微尺度热泳（MST）是一种新的方法，可以定量分析溶液中微升的分子间的相互作用 MST 是基于热泳效应，即沿温度梯度定向的分子运动。

一个空间的温度差ΔT 导致分子浓度在温度升高的地区的变化， 用 Soret 系数 ST 定义为：C 热/ C 冷= EXP（-STΔT） 热泳取决于分子和溶剂之间的界面在恒定的缓冲条件下，热泳反映出分子大小，电荷和溶剂化熵 一个荧光标记分子 A 的热泳由于大小、电荷和溶剂化熵的差异通常显著不同于分子和靶标形成的复合物 AT这种分子的热泳的区别可以用来量化在一定缓冲条件下，梯度滴定实验的结合常数 MST 技术介绍 测量荧光标记分子的热泳运动是通过监测荧光毛细管内分布 F微观的温度梯度产生的红外激光，这是集中到毛细管强烈被水吸收 水溶液在激光光斑的温度升高ΔT= 5 K.之前的红外激光是在同质化的荧光分布 F 是毛细管内观察到的冷切换 当红外激光开关，两方面的影响，其时间尺度分离，有利于新的荧光分布 F 热 热弛豫时间快和诱导荧光染料，由于当地环境的依赖反应温度跳跃约束力的依赖下降 在较慢的扩散时间尺度（10 秒），分子运动从局部加热区域外的低温地区 当地的分子浓度降低，直到达到一个稳态分布在激烈的地区 虽然质量扩散 D 的决定消耗的动力学，S T 确定的稳态浓度比例下温度上升 chot/ccold=exp(-ST ΔT) ≈ 1-ST ΔT。

归一化荧光 Fnorm = F热/ F冷主要是这个浓度比，除了温度跳跃∂F /∂T 的线性近似，我们发现：Fnorm = 1 +（∂F /∂TST）的温差由于荧光强度的线性和热泳枯竭，Fnorm（A）未结合的分子归荧光和约束复杂的 Fnorm（AT）线性叠加 表示x 的绑定到目标分子的一小部分， 在目标 T 滴定的荧光信号不断变化的计算公式如下： Fnorm=(1-x) Fnorm(A)+x Fnorm(AT) 定量绑定参数获得通过的约束力基板的连续稀释通过绘制 F 规范对系列稀释的不同浓度的对数，获得一个 S 形的结合曲线这种结合曲线，可以直接安装质量作用定律的非线性解与解离常数 K ð，作为结果微量热泳（MST）是一种分析生物分子的技术微尺度热泳是粒子在微观的温度梯度中的定向运动生物分子结构/构象的变化引起的水化层的变化导致的 实验流程： 很简单的实验方法,避免了昂贵的样品消耗和繁琐的制备过程 结合毛细管使用，大大降低其他的标准的分子相互作用的技术所需的实验成本，并且可以测量天然状态环境中的生物分子间的相互作用 荧光分子的浓度的保持不变而结合分子的浓度梯度增加一个 4 ul 的样品量被填充在 MST 毛细血管，然后使用制造一个局部温度梯度。

由于标记分子在玻璃毛细管中的运动导致的区域荧光强度变化就会被观测到既可用标签/萤光蛋白来发光(NT.115 系统)，也可以用色氨酸自发荧光来检测(NT.LabelFree 系统) 荧光分子或颗粒最初是自由均匀分布的在红外激光照射下，分子收到热泳动的作用力，而移出加热区域，最后分子在热泳动作用力和质量扩散作用力下达到平衡，形成稳定态在关闭激光后，分子扩散重建均匀分布状态下图显示了该过程 主要特点： NanoTemper 独特的 MST 技术，可应用于： ☆ 直接在生物溶液环境中测量任何（生物）分子间亲和力(KD, 解离常数) ☆ 研究血清、细胞裂解液或其它生物溶液对生物分子的作用，并且能够分离出真正的结合过 ☆ 直接在细胞膜上研究膜结合蛋白 ☆ 研究溶液中酶活性、复合物形成、定向组装过程的多组分反应或者生化成分 ☆ 使用荧光标记竞争物以无标记的方式获得更大的筛选项目 (“竞争性 MST” ) ☆ 一个靶标上不同结合位点的区分 ☆ 研究酶动力学(vmax, kcat) ☆ 研究化学计量学并确定生物分子结合位点的数目 ☆ 研究结合能量学 ΔG (自由能 ), ΔH (焓) and ΔS (熵) ☆ 直接测量或是在竞争性实验中研究抑制物亲和力 Ki ☆ 这个方向是 MST 最常用的应用，一个结合物浓度固定，另一个梯度变化…不同于直接相互作用，这写实验中的荧光信号是被竞争物挤下来的分子发出的，用于研究竞争性结合物的结合能力…该研究使用与确定靶分子上的配体结合位点…该研究用于测定反应中的热力学参数，包括焓和熵… 应用说明： ☆ 直接相互作用 ☆ 竞争性相互作用 ☆ 化学计量学 ☆ 热力学  蛋白-蛋白  小分子  蛋白-核酸  蛋白-多肽  核酸-核酸  膜蛋白-膜蛋白  多亚组分复合体间  脂类或脂质体间  蛋白-离子 ☆ 竞争性相互作用 ☆ 化学计量学 ☆ 热力学 仪器设备： NT.115 和 NT.LabelFree 是部分优势互补的。

每个系统都有其特定的优势和特点， 您需要根据你的具体应用来考虑如果您有兴趣测量各种各样的不同的样品，我们建议考虑两个系统都使用 NT.115: 测量标记荧光 您可以在任何缓冲液和细胞裂解液类的复杂溶液中完成测量 通过标记，您可以测量各种结合试验，包括离子，核糖体，组蛋白以及多组分反应 您可以测量任何靶（生物）分子，而不依赖于梯度浓度的结合物独特的光谱学特征 您可以测量 sub-nM 到 mM 间的亲和力 NT.LabelFree: 测量内在荧光 您不需要经过标记步骤，因而能测量一些对标记过程敏感的蛋白，如跨膜受体 该系统非常敏感，甚至能检测靶标分子微小的基团的修饰 该系统能精确测量各种结合物，包括极弱甚至无内在荧光的分子，如核酸、糖、多数小分子和很多蛋白 您可以测量 10nM 到 mM 间的亲和力 。