edman降解法.ppt

Edman降解法,——蛋白质测序技术应用介绍,蛋白质测序 中文名称：蛋白质测序 英文名称： protein sequencing 定义：测定蛋白质分子的氨基酸排列顺序目前自动化的蛋白质测序仪系从肽链的N端测入当前，所谓蛋白质测序，主要指的是蛋白质的一级结构的测定蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目、多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础测序要求,●1 样品必需纯（97%以上） ●2 知道蛋白质的分子量； ●3 知道蛋白质由几个亚基组成； ●4 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数 ●5 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量Edman降解（Edmandegradation）：是测定蛋白质一级结构的方法，主要是从蛋白质或多肽氨基末端进行分析由埃德曼（P．Edman）在上世纪50年代所创立分为耦合、切割、萃取、转化、鉴定等几个步骤1.偶联 1）.定义： 是由两个有机化学单位(moiety)进行某种化学反应而得到一个有机分子的过程,实验过程,2）.异硫氰酸苯脂与蛋白质和多肽的N-端残基反应,异硫氰酸苯脂,蛋白质或多肽,苯氨基硫甲酰肽(PTC-肽 ）,具体操作： 在pH9．0的碱性环境下，将异硫氰酸苯酯(Ph—N=C=S，PITC)和蛋白质或多肽N端氨基酸偶合，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物；,实验过程,2.环化裂解 1）.定义 环化：分子中形成环状结构 裂解：裂解是指只通过热能将一种样品（主要指高分子化合物）转变成另外几种物质（主要指低分子化合物）的化学过程。

实验过程,2）.苯氨基硫甲酰衍生物硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物而从肽链上掉下来苯氨基硫甲酰衍生物,苯乙内酰硫脲衍生物,剩余完整肽链,具体操作 以三氟乙酸(TFA)处理耦合后产物，将多肽或蛋白的N一端第一个肽键选择性的切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物,实验过程,3.转化,1）.苯乙内酰硫脲衍生物转化为苯乙内酰硫氨基酸,苯乙内酰硫脲衍生物,苯乙内酰硫氨基酸,具体操作： 萃取出释放的氨基酸衍生物并在强酸性条件下转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH．氨基酸),实验过程,异硫氰酸苯酯与所有氨基酸残基的反应产率和回收率都相当高，因此反应副产物少，用色谱可以准确鉴定Edman降解法的优点,对大多数氨基酸残基而言，30 min的耦合反应时间、5 min的切割反应时间都已足够剩下的肽链仍是完整的，可依照此法重复测定新生的N末端氨基酸,应用：,全自动蛋白质/多肽 N末端氨基酸序列分析仪,,应用：全自动蛋白质测序仪,四个主要部件 􀁺蛋白质测序仪主机 􀁺微梯度运送系统 􀁺紫外检测器 􀁺型数据分析软件,应用：全自动蛋白质测序仪,,如需要，脱盐处理或样品浓缩,样品,,NEXT,应用：全自动蛋白质测序仪,,偶联,以气态形式输送12%三甲基胺水溶液（维持碱性环境等）,,输送5 PITC （异硫氰酸苯脂）正庚烷溶液 重复碱的输送,,45—48°C反应、惰性气体流干燥 正庚烷和乙酸乙酯重复洗涤,,NEXT,,应用：全自动蛋白质测序仪,裂解,输送几微升无水三氟乙酸(TFA)45—48°C反应 惰性气体流干燥除酸,ATZ 氨基酸丁基氯溶液输送人转化器 重复丁基氯抽提,输送丁基氯以溶解释放的苯胺唑啉酮(ATZ 氨基酸),,,,NEXT,,应用：全自动蛋白质测序仪,,转化,输送25 %--40%无水三氟乙酸水溶液(转化介质R4)至转化器,45 ~50°C 转化10— 20 分钟,PTH 氨基酸溶解于一种合适的溶剂混合物(S4) (如20 %乙腈水溶液含或不含乙酸钠添加剂以调节pH) 这样可直接注入HPLC 系统的HPLC 上柱,,,,NEXT,,应用：全自动蛋白质测序仪,,结果分析,运行PTH-氨基酸并校准,将每个循环切割下来的氨基酸于PTH-氨基酸进行比较并与前后循环的氨基酸进行比较确定N-末端氨基酸序列,运行空白循环,,,,END,,应用：全自动蛋白质测序仪,,THANKS,。