培养基(含测试试剂)质量控制规程03-506d.doc

文件类型：操作指导书 第01版第0次修改 文件名称：培养基（含测试试剂）质量控制规程 文件编码：WHHDSPJT/QM03-506D-00培养基（含测试试剂）质量控制规程一、培养基制备要求培养基的一般性状：液体培养基应透明、清亮，颜色符合要求固体培养基应表面湿润但无水汽、平整光滑，厚薄均匀，一般厚度在3mm（M-H平板厚度不得<4mm）斜面的长度不得超过试管长度的2/3)PH值应在规定值±0.2的范围内培养基制备的质量将直接影响微生物生长因为各种微生物对其营养要求不完全相同，培养目的的不同，各种培养基制备要求如下：1. 根据培养基配方的成分按量称取，然后溶于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验2. PH测定及调节：PH测定要在培养基冷至室温时进行，因在热或冷的情况下，其PH有一定差异，当测定好时，按计算量加入碱或酸混匀后，应再测试一次培养基PH值一定要准确，否则会影响微生物的生长或影响结果的观察但需注意因高压灭菌可影响一些培养基的PH降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培养基的质量，指示剂、去氧胆酸钠、琼脂等一般在调完PH后再加入。

3. 培养基需保持澄清，便于观察细菌的生长情况，培养基加热煮沸后，可用脱脂棉花或绒布过滤，以除去沉淀物，必要时可用鸡蛋白澄清处理，所用琼脂条要预先洗净凉干后使用，避免因琼脂含杂质而影响透明度4. 盛装培养基不宜用铁、铜等容器，使用洗净的中性硬质玻璃容器为好5. 培养基的灭菌既要达到完全灭菌目的，又要注意不因加热而降低其营养价值，一般121℃15min即可，如为含有不耐高热物质的培养基如糖类、血清、明胶等，则应采用低温灭菌或间歇法灭菌，一些不能加热的试剂如亚碲酸钾、卵黄、TTC、抗菌素等，待基础琼脂高压灭菌后凉至50℃左右再加入6. 每批培养基制备好后，应做无菌生长试验及所检菌株生长试验如果是生化培养基，使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常反应，培养基不应贮存过久，必要时可置4℃冰箱存放7. 目前各种干燥培养基较多，每批需用标准菌株进行生长试验或生化反应观察，各种培养基用相应菌株生长试验良好后方可应用，新购进的或存放过久的干燥培养基，在配制时也应测PH，使用时需根据产品说明书用量和方法进行8. 每批制备的培养基所用化学试剂、灭菌情况及菌株生长试验结果、制作人员等应做好记录，以备查询。

二、培养基的质量控制培养基的质量控制主要包括三方面的内容：pH测试、无菌试验以及已知菌生长试验如果使用商品化脱水培养基，严格按照说明操作，一般不必再进行pH测试如果使用基础物质进行培养基制备，在培养基冷却后须进行pH测试如果pH测得值与预期值相差0.2单位，则需要酸碱调节；无菌试验一般为随机抽样3-5％，在35℃条件下培养48h如果抽样中每个培养基上出现2个以上菌落，证明本批培养基已被污染；已知菌生长试验的前提条件是实验室有足够的已知菌储备，其中包括标准菌株(如ATCC或NCTC标准菌株)及经过准确鉴定的临床分离菌如果条件允许，提倡使用标准菌株有关常用培养基的已知菌生长试验见表1表1 常用培养基已知菌生长试验 培养基 孵育条件 已知菌株(ATCC) 预期结果 血琼脂 需氧或 化脓性链球菌19615 生长并产生a-溶血 C02，24h 肺炎链球菌6305 生长并产生β-溶血 大肠埃希菌25922 生长 巧克力琼脂 CO2，24-48h 淋病奈瑟菌43069 生长 流感嗜血杆菌10211 生长 麦康凯琼脂 需氧，24h 大肠埃希菌25922 生长，粉红色菌落 (不含结晶紫) 奇异变形杆菌12453 生长，无色菌落，迁徙现象受抑制 　　　　　　　 鼠伤寒沙门菌14028 生长，无色菌落 粪肠球菌29212 生长 金黄色葡萄球菌25923 生长，粉红色菌落 大肠埃希菌25922 生长，粉红色菌落 麦康凯琼脂 需氧，24h 奇异变形杆菌12453 生长，无色菌落，迁徙现象受抑制(含结晶紫) 　　　 　　　　　　　　　　　　鼠伤寒沙门菌14028 生长，无色菌落 粪肠球菌29212 抑制(部分或完全) 金黄色葡萄球菌25923 抑制(部分或完全) 鼠伤寒沙门菌14028 生长 福氏志贺菌12022  生长 SS琼脂 需氧，24h 粪肠球菌29212 抑制(部分或完全) 大肠埃希菌25922 抑制(部分或完全) 大肠埃希菌25922 生长 营养肉汤 需氧，24-48h 金黄色葡萄球菌25923 生长 (无添加物) 1、无菌试验 新制备的培养基要按批号随机抽取一定数量的标本作无菌试验。

无细菌生长结果合格，有细菌生长，说明培养基已受杂菌污染，除了寻找原因外，应不再使用 对于分装后进行灭菌的培养基，一般随机抽取5%~10%，置35℃卵育24h对无菌手续分装的培养基，则应对全部培养基35℃卵育24h对选择性培养基，应取部分培养基加入10~20倍无抑制性肉汤培养基如TSB，稀释抑制物质，置35℃卵育24h2、细菌生长试验 要用已知标准菌株按照NCCLS推荐的方法测定培养基性能是否符合要求 保存Ø 避光 Ø 避热Ø 存放阴凉处，其保存期限与所用储存的容器类型有关Ø 常用的保存期为：Ø ①用脱脂棉堵塞的试管，1周；Ø ②用软木塞堵的试管，2周；Ø ③有旋盖的容器，3周；Ø ④平皿培养基（放在密封的塑料袋中），4℃1周；Ø ⑤平皿培养基，当天培养基空气卵育时间质控菌株（ATCC号）预期结果肉汤需氧24h鼠伤寒沙菌（14028）传代生长宋内氏志贺菌（9290）传代生长大肠埃希氏菌（25922）传代受抑制EMB需氧24h鼠伤寒沙菌（14028）生长，无色到琥珀色菌落粪肠球菌（9290）（部分）大肠埃希氏菌（25922）生长，蓝黑色菌落HE需氧24h鼠伤寒沙菌（14028）生长，蓝至蓝绿色菌落，有黑心福氏志贺氏菌（12022）生长，绿至蓝绿色菌落大肠埃希氏菌（25922）抑制（部分至完全，黄色菌落）Ø 用冻存的质控菌种最多向下传三代，就应更换质控菌种。

过多的传代会增加表型改变的机会Ø 制备工作质控菌种，用冻存的质控菌种接种一个琼脂斜面或平板，卵育过夜或得到足够的量为止这些工作琼脂斜面或平板上的培养物应贮存于2~8℃，或者室温，可放4个星期菌种再传代后应检查纯度和典型的菌落形态Ø 厌氧菌的工作质控菌株应在庖肉培养基或其它适宜的厌氧肉汤培养基中保存，或冷冻保存菌种，不应使用琼脂斜面或平板三、细菌染色的质量控制 染色是细菌学检查最常使用的方法，根据染色部位及染色目的不同可分为革兰染色、抗酸染色、鞭毛染色、异染颗粒染色和荚膜染色等其中革兰染色和抗酸染色使用频率最高现对这两种染色方法加以说明1．革兰染色 1)严格按照标本收集程序取样并涂片 2)对涂片进行严格编号或标识 3)在固定涂片时，避免玻片加热过度 4)染液放置处避免高温、干燥及灰尘 5)利用过滤的方法去除结晶紫的固体结晶 6)如果卢戈氏碘染液褪色，应立即更新 7)利用标准菌株(金黄色葡萄球菌ATCC25923及大肠埃希菌ATCC25922)或其他已知的革兰阳性菌及革兰阴性菌至少每周进行一次质量验证 2．妻一尼染色 1)严格按照标本收集程序取样并涂片 2)对涂片进行严格编号或标识 3)每次使用新玻片，不可重复使用 4)在固定涂片时，避免玻片加热过度 5)利用过滤的方法去除石炭酸复红染液中的沉淀 6)利用已知的抗酸杆菌(AFB)阳性涂片每周或在更新炭酸复红染液时至少进行一次质量验证 7)阳性涂片应置于专门器具专门地点保存以备复验 8)阴性涂片至少保存两周以备复验 四、细菌鉴定或鉴别常用试验的质量控制 细菌鉴定或鉴别主要依据细菌的形念特点、染色特点、培养特征、生化反应及血清学特征等。

细菌这些生物表型特征或按固定组合的方式被用于细菌鉴定，或以灵活组合的方式用于细菌鉴定、鉴别及补充试验无论怎样，这些生物表型检测的准确与否直接影响细菌鉴定的准确性下面将列举一些常用且较为关键的试验，并对其质量控制方法加以说明，见表2表2 常用细菌鉴定或鉴别试验的质量控制 试验名称 质控周期 阳性质控 阴性质控 质控菌 结果 质控菌 结果 触酶试验 每次使用时 金黄色葡萄球菌 有气泡产生 化脓性链球菌 无变化 凝固酶试验 每次使用时 金黄色葡萄球菌 与人、兔或猪血 表皮葡萄球菌 无凝固现象 浆产生凝固现象 氧化酶试验 每次使用时 铜绿假单胞菌 根据方法学不同可 大肠埃希菌 无颜色改变 产生粉红色或紫色 奥普托欣敏感性试验 每周 肺炎链球菌 纸片周围出现抑菌圈 化脓性链球菌 纸片周围细菌均一生长 杆菌肽敏感性试验 每周 化脓性链球菌 纸片周围出现抑菌圈 无乳链球菌 纸片周围细菌均一生长 CAMP试验 与被测试菌株同 无乳链球菌 质控菌生长条带在靠 化脓性链球菌 无溶血程度加重区出现 步进行 金黄色葡萄球菌区 内出现溶血加强 胆汁溶菌试验 每批号(在允许的储存 肺炎链球菌 菌落溶解 缓症链球菌 无菌落溶解现象 条件和使用期限内) 胆汁七叶苷试验 每批号(在允许的储 粪肠球菌 使琼脂斜面变黑 牛链球菌 琼脂斜面无黑色出现 。