第二章基因工程制药新版3p教学案例.ppt

第三节第三节 基因工程制药生产的基本过程基因工程制药生产的基本过程一、工具酶的分离纯化一、工具酶的分离纯化二、载体的分离纯化二、载体的分离纯化三、外源三、外源DNADNA和目的基因的分离和获得和目的基因的分离和获得四、外源四、外源DNADNA与载体与载体DNADNA的切割与连接的切割与连接五、宿主细胞的选择和基因导入操作五、宿主细胞的选择和基因导入操作六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点七、基因工程菌中试七、基因工程菌中试八、基因工程菌的扩增和发酵生产八、基因工程菌的扩增和发酵生产九、基因工程药物的分离和纯化技术九、基因工程药物的分离和纯化技术十、变性蛋白的复性十、变性蛋白的复性十一、基因工程药物的质量控制十一、基因工程药物的质量控制十二、基因工程药物的制造实例十二、基因工程药物的制造实例三、外源三、外源DNADNA和目的基因的分离和获得和目的基因的分离和获得（一）基本操作方法（一）基本操作方法（二）不同类别（二）不同类别DNADNA的提取技术的提取技术（三）目的基因的制备（三）目的基因的制备（一）基本操作方法（一）基本操作方法 细胞内的细胞内的DNADNA大多与大多与RNARNA及蛋白质形成复合物，需及蛋白质形成复合物，需要经过提取、分离、纯化，才能获得高纯度的要经过提取、分离、纯化，才能获得高纯度的DNADNA。

1 1、操作条件、操作条件 2 2、提取方法、提取方法 3 3、分离方法、分离方法 4 4、纯化方法、纯化方法2 2、提取方法、提取方法（1 1）机械法）机械法-破坏细胞，释放出破坏细胞，释放出DNADNA2 2）酶消化法）酶消化法-破坏细胞，释放出破坏细胞，释放出DNADNA3 3）用酶使蛋白质变性）用酶使蛋白质变性-除去蛋白质之后，就剩除去蛋白质之后，就剩下下DNADNA4 4）用酚、去垢剂使蛋白质变性）用酚、去垢剂使蛋白质变性-除去蛋白质，除去蛋白质，剩下剩下DNADNA3 3、分离方法、分离方法 是指从大分子的是指从大分子的混合物中分离出混合物中分离出DNADNA具体方法具体方法有：有：（1 1）DEAEDEAE纤维纤维素柱层析法素柱层析法2 2）羟基磷灰石）羟基磷灰石柱层析法柱层析法4 4、纯化方法、纯化方法分子筛层析法分子筛层析法凝胶电泳法凝胶电泳法乙醇、三氯醋酸、聚乙二醇沉淀法乙醇、三氯醋酸、聚乙二醇沉淀法二）不同类别（二）不同类别DNADNA的提取技术的提取技术1 1、质粒、质粒DNADNA的提取的提取2 2、细菌染色体、细菌染色体DNADNA的提取的提取3 3、真核生物、真核生物DNADNA的提取的提取4 4、病毒、病毒DNADNA的提取的提取1 1、质粒、质粒DNADNA的提取的提取 细菌培养细菌培养 质粒扩增质粒扩增 菌落收集菌落收集 溶菌技术溶菌技术 分离技术分离技术-采用热或者碱使采用热或者碱使DNADNA变性变性，然后再进行，然后再进行冷却或者恢复到冷却或者恢复到中性中性PHPH值值，由于质粒，由于质粒DNADNA易于复性，易于复性，而染色体而染色体DNADNA则不易复性、会沉淀下来则不易复性、会沉淀下来 提纯技术提纯技术-采用溴乙锭密度梯度离心、二碘丙锭的采用溴乙锭密度梯度离心、二碘丙锭的氯化铯密度梯度离心，质粒氯化铯密度梯度离心，质粒DNADNA插入染料区带较多、插入染料区带较多、而染色体而染色体DNADNA插入染料区带则较少。

从而可以分离插入染料区带则较少从而可以分离2 2、细菌染色体、细菌染色体DNADNA的提取的提取 采用冻融、溶菌酶、采用冻融、溶菌酶、EDTAEDTA处理、去垢剂处理使得细胞裂解处理、去垢剂处理使得细胞裂解 裂解液用胰裂解液用胰RNaseRNase和蛋白酶处理，使和蛋白酶处理，使RNARNA和蛋白质降解和蛋白质降解 残留蛋白质用酚溶液、或者用（酚：氯仿残留蛋白质用酚溶液、或者用（酚：氯仿=1=1：1 1）溶液进）溶液进行抽取和离心，使提大部分蛋白质因为变性而沉淀于有机行抽取和离心，使提大部分蛋白质因为变性而沉淀于有机相与水相之间相与水相之间 含含DNADNA的水相用的水相用乙醇沉淀乙醇沉淀，以获得，以获得丝状的丝状的DNADNA沉淀物，沉淀物， 沉淀物用缓冲液透析，除掉去垢剂和有机溶剂沉淀物用缓冲液透析，除掉去垢剂和有机溶剂 最后采用氯化铯（最后采用氯化铯（CsCl2CsCl2）进行密度梯度离心法分离进行密度梯度离心法分离3 3、真核生物、真核生物DNADNA的提取的提取（1 1）提取方法）提取方法 同同2 2（2 2）注意事项）注意事项 对于纯度要求较高的对于纯度要求较高的DNADNA，必须采用，必须采用氯化铯（氯化铯（CsCl2CsCl2）密度梯度离心法）密度梯度离心法进行分离。

进行分离 操作时要防止丢失线粒体操作时要防止丢失线粒体DNADNA、和卫星、和卫星DNADNA等密度等密度异常成份异常成份 要防止低分子量的要防止低分子量的DNADNA的污染4 4、病毒、病毒DNADNA的提取的提取 用少量用少量噬菌体感染宿主，然后用大量的培养噬菌体感染宿主，然后用大量的培养基进行感染细菌的培养，最后全部细菌都会被基进行感染细菌的培养，最后全部细菌都会被噬菌体感染此法适应于制备大多数噬菌体噬菌体感染此法适应于制备大多数噬菌体三）目的基因的制备（三）目的基因的制备目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因需要克隆的需要克隆的DNADNA片段片段编码某种蛋白质编码某种蛋白质研究某基因结构和功研究某基因结构和功能的关系能的关系研究某基因与疾病研究某基因与疾病的关系的关系1 1、物理分离法、物理分离法2 2、化学合成法、化学合成法3 3、逆转录法、逆转录法4 4、RT-PCRRT-PCR技术法技术法5 5、筛选新基因的其它新方法、筛选新基因的其它新方法1、物理分离法（1）分离方法（2）物理分离法实例（1）分离方法 直接用酶切割、或者机械破碎分离法DNA经过直接用酶切割、或者机械破碎之后，可产生编码不同基因的DNA片段，由于不同基因中的G-C碱基对含量、与A-T碱基对含量有差异，结果就导致它们之间的密度不同，因此通过分离技术+观察技术+鉴定技术结合，就能将其分离。

分离技术-平衡等密度离心法、凝胶电泳法、溴乙锭染色法 观察技术-荧光显微镜观察 鉴定技术-核酸杂交法、瑟萨恩印迹转移技术物理学密度梯度离心法物理学密度梯度离心法 不同不同DNADNA片片段，其密度段，其密度不同，借此不同，借此进行密度梯进行密度梯度离心，实度离心，实现分离凝胶电泳分离技术凝胶电泳分离技术n n通过凝胶电泳，通过凝胶电泳，分段收集大小不分段收集大小不同的同的DNADNA片段，片段，n n然后用快速转化然后用快速转化法来检验其目的法来检验其目的蛋白质，进行基蛋白质，进行基因定位实现分因定位实现分离2 2）物理分离法实例）物理分离法实例海胆组蛋白基因海胆组蛋白基因苏芸金杆菌晶体蛋白基因苏芸金杆菌晶体蛋白基因多角病毒的多角体蛋白基因多角病毒的多角体蛋白基因-半乳糖苷酶蛋白基因半乳糖苷酶蛋白基因2 2、化学合成法、化学合成法（1 1）化学合成法的概念）化学合成法的概念（2 2）化学合成法的优缺点）化学合成法的优缺点（3 3）化学合成法的实例）化学合成法的实例（1 1）化学合成法的概念和分类）化学合成法的概念和分类 概念-以5或3-脱氧核苷酸、5-磷酰基寡核苷酸片段为原料，用化学方法，将其逐个缩合成基因的方法，称为化学合成法。

1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文要求：1、已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 2、分子量较小的目的基因的制备 DNA多聚酶Klenow 片段+dNTPs磷酸化退火分子克隆磷酸化退火DNA多聚酶Klenow 片段限制性内切酶分子克隆基因的化学-酶促合成图解（2 2）化学合成法的优缺点）化学合成法的优缺点n n化学合成法的优点化学合成法的优点-随意性强随意性强，可通过人工设计，进行，可通过人工设计，进行合成、组装非天然基因，为实施蛋白质工程提供了强有合成、组装非天然基因，为实施蛋白质工程提供了强有力的手段，力的手段，较小分子蛋白质或多肽编码的基因， 15-30bp效果最好，1天完成现在可达到一次合成寡核苷酸片段长达50-60bpn n化学合成法的缺点：化学合成法的缺点：（1 1）反应专一性不强、副反应多）反应专一性不强、副反应多; ;（2 2）合成片段越长、分离纯化越困难、产率越低）合成片段越长、分离纯化越困难、产率越低; ;（3 3）无法合成太长的基因，无法合成太长的基因，不能大于60bp; （4 4）人工合成基因时，遗传密码子的简并给选定密码子）人工合成基因时，遗传密码子的简并给选定密码子带来很大困难，带来很大困难，人工合成时，遗传密码的简并性可导致中性突变; ; （5 5）合成）合成费用较高费用较高。

3 3）化学合成法的实例）化学合成法的实例 讫今为止，通过化学合成方法已经了近百种产讫今为止，通过化学合成方法已经了近百种产物的基因主要有以下种类：物的基因主要有以下种类： 细菌酪氨酸细菌酪氨酸t-RNAt-RNA人生长激素人生长激素干扰素干扰素干扰素干扰素血管紧张素血管紧张素人胰岛素人胰岛素人生长激素抑制释放因子人生长激素抑制释放因子溶菌酶溶菌酶组织血纤维蛋白溶酶原激活剂组织血纤维蛋白溶酶原激活剂3 3、逆转录法、逆转录法（1 1）逆转录法的理由）逆转录法的理由（2 2）逆转录法的理论依据）逆转录法的理论依据（3 3）逆转录所产生的）逆转录所产生的DNADNA的特性的特性（4 4）逆转录法的具体步骤）逆转录法的具体步骤（5 5）逆转录法的实例）逆转录法的实例（1 1）逆转录法的理由）逆转录法的理由 真核生物的基因不能直接分离，原因：真核生物的基因不能直接分离，原因：（A A）单一拷贝的基因只占到真核生物基因组的）单一拷贝的基因只占到真核生物基因组的十万十万千万分之一千万分之一，数量十分微小，这就导致直接从真核，数量十分微小，这就导致直接从真核生物染色体上制备目的基因的生物染色体上制备目的基因的极为困难极为困难。

B B）真核基因内一般都有）真核基因内一般都有内含子内含子，会阻止基因的不正，会阻止基因的不正常表达C C）将真核基因导入到原核细胞之中，由于原核细胞）将真核基因导入到原核细胞之中，由于原核细胞中缺乏中缺乏mRNAmRNA转录后的加工系统，因此，从真核基因转录后的加工系统，因此，从真核基因转录出的转录出的mRNAmRNA无法提到加工处理，也就不能成为成无法提到加工处理，也就不能成为成熟的熟的mRNAmRNA2 2）逆转录法的理论依据）逆转录法的理论依据逆转录法就是从逆转录法就是从mRNAcDNADNAmRNAProteinmRNAcDNADNAmRNAProtein的方的方法A A）提取真核细胞的）提取真核细胞的mRNAmRNAB B）以）以mRNAmRNA为模板，在逆转录酶有作用下，为模板，在逆转录酶有作用下，反转录合成反转录合成cDNAcDNA第一链C C）再以）再以cDNAcDNA为模板，在为模板，在DNADNA聚合酶的作用聚合酶的作用下，合成下，合成DNADNA互补双链互补双链3 3）逆转录所产生的）逆转录所产生的DNADNA的特性的特性（A A）只反映）只反映mRNAmRNA经过加工之后的经过加工之后的基因编码序基因编码序列列，而不象真核生物的原始，而不象真核生物的原始DNADNA那样具有复杂那样具有复杂的信息承载。

的信息承载B B）不含内含子不含内含子，可以在任何场合进行表达可以在任何场合进行表达4 4）逆转录法的具体步骤）逆转录法的具体步骤A A、mRNAmRNA的纯化的纯化B B、cDNA。