核酸3核酸的理化性质.ppt

第三章 核酸,Nucleic Acid,核酸的性质及序列测定,第四节,一、核酸的一般理化性质,1、状态：DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末； 2、溶解性：微溶于水，不溶于一般有机溶剂（乙醇沉淀核酸），其钠盐易溶于水； 3、粘度：DNA的粘度极高，而RNA粘度要小得多；,（一）物理性质,核酸酶是指所有可以水解核酸的酶3',5'-磷酸二酯键断裂 切割点不同，产物不同，如3‘-单核苷酸，5’-单核苷酸 水解磷酸二酯键的酶：核酸酶,（二）稳定性,核酸可被酸、碱或酶水解成各种组分，即核酸的降解,（1）碱水解：RNA可在室温下被稀碱水解成核苷酸，而DNA对碱稳定例如，在0.1mol/L NaOH溶液中，RNA几乎完全水解，随着磷酸二酯键的断裂，先生成2´,3´-环核苷酸中间物，最后生成2´-或3´-磷酸核苷的混合物；DNA由于不存在2´-OH，不能被碱水解利用上述性质可测定RNA的碱基组成或除去溶液中的RNA1、酸或碱水解,DNA和RNA对酸或碱的耐受程度不同2）酸水解酸性条件下，磷酸二酯键比糖苷键稳定，嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键稳定性最差若对核酸进行酸水解，首先生成的是无嘌呤酸因此对核酸进行部分水解时，很少采用酸水解。

1、酸或碱水解,根据底物不同：DNA水解酶（DNase）RNA水解酶（RNase） 根据作用方式：核酸外切酶 (限制性和非限制性)核酸内切酶 (5´→3´或3´→5´) 核酸内切酶的作用方式是从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键 核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3´-端或5´-端）开始，逐个水解切除核苷酸,3、酶水解,核酸酶分类,5’,5’,3’,3’,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,外切位点,外切位点,内切位点,内切位点,实验室常用的RNase有3种：牛胰核糖核酸酶（RNase I）：专一性内切酶，产物为3´-嘧啶核苷酸及以3´-嘧啶核苷酸为结尾的寡核苷酸核糖核酸酶T1：产物为3´-嘌呤核苷酸及以3´-嘌呤核苷酸为结尾的寡核苷酸核糖核酸酶T2：主要作用于Ap残基，将tRNA降解为 3´-腺苷酸为末端的寡核苷酸3、酶水解,实验室常用的DNase有2种：牛胰脱氧核糖核酸酶I（DNase I）：水解产物为平均长度为4个核苷酸，以5´-P为末端的寡聚核苷酸牛胰脱氧核糖核酸酶II（DNase II）：水解产物为平均长度为6个核苷酸，以3´-P为末端的寡聚核苷酸。

3、酶水解,非特异性核酸酶：即水解DNA又水解RNA的酶有些非特异性核酸酶也作为工具酶应用到科学研究中如：蛇毒磷酸二酯酶和脾磷酸二酯酶均是水解DNA和RNA的外切核酸酶前者从3´端开始，生成5´单核苷酸，后者从 5´末端开始，生成3´单核苷酸D-核糖与浓盐酸和苔黑酚（甲基间苯二酚）共热产生绿色；D-2-脱氧核糖与酸和二苯胺一同加热产生蓝紫色 以此区别DNA和RNA，或作为定量测定基础二、核酸的紫外吸收,DNA或RNA的定量 A260 = 1.0 相当于 50μg/ml 双链DNA (dsDNA) 40μg/ml 单链DNA (ssDNA or RNA) 20μg/ml 寡核苷酸 确定样品中核酸的纯度 纯 DNA: A260/A280 = 1.8纯 RNA: A260/A280 = 2.0,紫外吸收的应用,与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质 由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低如DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5三、核酸的酸碱性质及等电点,1、概念：指核酸的双螺旋区的氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规则线团状态的过程 2、变性因素：加热、酸碱度改变、有机溶剂、酰胺、尿素等。

3、DNA变性的实质：DNA双链间氢键的断裂，生物活性丧失四、核酸的变性、复性与杂交,（一）核酸的变性,4、特点：并不涉及共价键的断裂，即磷酸二酯键不发生断裂，因此一级结构不发生变化 5、变性后其它理化性质变化：OD260增高；粘度下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲线改变一）核酸的变性,增色效应(hyperchromic effect)：DNA变性时其溶液OD260增高的现象6、DNA的热变性和熔解温度（Tm）,,DNA的解链曲线,连续加热DNA的过程中以温度相对于A260值作图，所得的曲线称为解链曲线解链过程中，紫外吸光度的变化达到最大变化值的一半时所对应的温度，称为熔解温度，用Tm表示，也称解链温度熔解温度(melting temperature, Tm),（1）G-C对含量：G-C的含量高，Tm值高因而测定Tm值，可反映DNA分子中G 、C含量，可通过经验公式计算： （G+C)%=(Tm-69.3)×2.44 （2）溶液的离子强度：离子强度较低的介质中DNA的Tm较低在纯水中，DNA在室温下变性 （3）溶液的pH值和变性剂,影响Tm的因素,1、复性：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的单链重新缔合成为双螺旋结构的过程 退火：将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。

但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性，又称“退火”二）核酸的复性,2、复性表现：许多理化性质可恢复，生物活性得以部分恢复 3、影响复性的因素：分子量越大复性越难；浓度越大，复性越容易；DNA的复性也与它本身的组成和结构有关DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关二）核酸的复性,DNA复性,核酸杂交：核酸变性后进行复性的过程中，来源不同的DNA（或RNA）片段，按碱基互补关系形成杂交双链分子的过程杂交双链可在DNA与DNA链之间，也可在RNA与DNA链之间形成杂交的本质就是在一定条件下使互补核酸链实现复性核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义三）核酸的杂交,,核酸分子杂交,应用最广 原理： 碱基配对； 聚合酶可催化在试管内合成与模板互补的 DNA新链； 双脱氧核苷酸无3’-OH，合成到此终止； 可电泳分离随机得到的大小不等的片段六、核酸序列测定——Sanger法,双脱氧法,核酸序列测定,计算机读序,。