中药色谱分析06-色谱联用技术2.ppt

现代色谱-质谱联用技术及其在中药分析中的应用2,液质联用系统,质量过滤器,API 电离源LC/MS- Waters Alliance ZMD 系统,Agilent 1100 Series LC/MSD,Varian 1200L LC/MS & LC/MS/MS,1200L LC/MS/MS Analyzer,？？LC与MS联用面临的问题？？, 将常规LC每分钟约1ml或数ml流速的液体流动相引入要求高真空操作的MS仪，引起流速不协调;  经典离子化方法的高温高电压不适合LC分析的热不稳定性或难挥发性样品的离子化;  LC分析常用的难挥发性缓冲盐系统易污染MS仪,LC/MS联用的接口技术,*直接液体导入接口(Direct Liquid Introduction) *传送带技术(Moving Belt Interface) 流出物滴落在传送带上，红外线加热去溶剂 缺点：离子化效率低；记忆效应 *热喷雾(Thermospray) 流动相经过喷雾探针时被加热，体积膨胀后以超声速喷出形成雾滴，离子蒸发；流速1ml/min，水相多 缺点：MW200-1000u；热分解,LC/MS：ESI 结构图,,Finnigan ESI,Agilent ESI,AB ESI,Waters ESI,Varian ESI,,,,,,Electrospray Ionization, desolvation, excess droplet removal,,,,,,,,,Gas Heater,N2 drying gas,Vacuum Restriction,Drying gas promotes rapid desolvation and blows large droplets away from capillary inlet,Ions,Droplets,Electrospray Mechanism,,,,,,,,,,,+,+,+,+,+,+,,,,+,+,+,+,,,,,,,,,+,+,+,+,,+,+,,Desolvation,Needle,Charged Droplet,,Analyte,Ionization,LC-MS ionization,LC-MS ionization,,Hot Drying Gas,,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,,,,,solvent,solvent,solvent,solvent,LC-MS ionization,LC-MS ionization,,,,,,,Liquid,Nebulizing Gas,,,,,,,,,Optimum depends on liquid flow,Inner to outer needle position is critical to nebulization efficiency,液滴分布状态,,,Spray needle,Spreading due to charge repulsion,,,,,Electrospray Ionization, desolvation, excess droplet removal,,,,,,,,,Gas Heater,N2 drying gas,Vacuum Restriction,Drying gas promotes rapid desolvation and blows large droplets away from capillary inlet,Ions,Droplets,进入四级杆质量分析器,,,,,,,,,,,,,,3.5 mTorr,0.8 Torr,,Droplets,Ions,,,,Droplet desolvation occurs before entrance to the capillary. Ion/Solvent clusters are dissociated by collisions before the skimmer cone and in the ion guide.,Ions,Ion Guide,,分析物离子化,Analyte forms an ion in the mobile phase Positive Ion ESI Cation attachment: H+ + M  (M+H)+ also Na+, K+, NH4+ Negative Ion ESI Proton loss: M  (M-H)- + H+ Anion attachment: A- + M  (M+A)-,示例：稳定母离子的确认,定量离子对： 多烯紫杉醇m/z 830→549.0（[TNa]+，图A） 紫杉醇 m/z 876→ 591.0（[TNa]+，图B）,不同甲酸浓度下多西他赛母离子的稳定性与灵敏度考察,加钠离子（m/z 830）2. 加钾离子（m/z 846 ） 3. 加氢离子（m/z 808 ）,,0‰ formic acid,0.05‰ formic acid,0.1‰ formic acid,0.2‰ formic acid,不同甲酸浓度下多西他赛子离子的稳定性与灵敏度考察,,0‰ formic acid,0.05‰ formic acid,0.1‰ formic acid,0.2‰ formic acid,1. 加钠离子（m/z 549）2. 加钾离子（m/z 565） 3. 加氢离子（m/z 527）,LC/MS：APCI 结构图,APCI : Nebulization &Vaporization,APCI is a gas phase reaction Analyte must be available as a stable, gas phase molecule Matrix components may or may not undergo non-destructive evaporation Evaporation driven by a very hot auxiliary gas,Ionization in the APCI Chamber,APCI 基本原理 从液相色谱流出的样品溶液进入一具有雾化气套管的毛细管，经氮气流雾化，通过加热管时被气化。

在加热管端进行电晕尖端放电．溶剂分子被电离，充当反应气，与样品气态分子碰撞，经过复杂的反应过程，样品分子生成准分子离子： R + e R+· + 2e RH+ + M MH+ + R,,,ESI APCI 对象 中等至强极性分子 非极性/中等极性 不适宜 极端非极性样品 热稳定性差/非挥发性 流动相 pH对离子化效率影响较大 缓冲盐浓度低 缓冲盐浓度可高些 有机相比例不能太低 水相比例可高些 流速 低流速较好 高流速比ESI好,LC LC/MS： *多数色谱柱与LC/MS匹配，离子交换柱除外 *使用有机溶剂比例较高的系统 *避免使用难挥发性缓冲盐，可用醋酸铵、甲酸铵、三氟乙酸； *使用挥发性离子对试剂：氢氧化四丁基铵（TBAH），七氟丁酸（HFBA） *流量匹配：兼顾色谱分离效果和ESI离子化效率；用1-2mm内径色谱柱，300-500ul/min；柱后分流,,Scan Modes – Full Scan全扫描,,,Scan Modes – SIM选择离子监测,,,Selected Ion Monitoring,Scan Modes – SRM选择反应监测,,,,,Collision induced dissociation,Selected Reaction Monitoring,Scan Modes – MRM多反应监测,,,,,Multiple Reaction Monitoring,,Scan Modes – Precursor Scan母离子扫描,,,Scan Modes – Product Scan子离子扫描,,,Scan Modes – Neutral Loss Scan 中性丢失扫描,,多种扫描模式设定,All modes are time programmable, with numerous time segments available for each method,Full Scan,SIM,SRM,MRM,Precursor Scan,Neutral Loss,,,,Scan:250-500,,,521,ESI(-),,,XIC 521,,XIC 523,,,Product Scan,Product Scan:523→100~523,361,,Neutral Loss Scan: 400~550→238~388,野鸢尾苷,LC/MS在中药研究中的应用,中药化学成分的快速筛选及成分分析 质谱检测器可以给出大量的结构信息，结合同类已知结构化合物的裂解规律，或结合其它检测方法，即可对未知成分进行直接分析，因此在以生物活性为指导的化学筛选中，可以对目标化合物进行靶分析 中药质量控制--中药指纹图谱研究 LC-MS联用技术的应用弥补了紫外检测的不足，还提供了大量的化学成分信息，可实现对各主要流出组分的定性，从而为药材及其制剂的鉴别及质量评价提供更加全面、可靠的依据,Identification of multiple components in Guanxinning injection using hydrophilic interaction liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry and reverse phase liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry Rapid Communications in Mass Spectrometry Xiaofei Chen, Ziyang Lou, Hai Zhang, Guangguo Tan, Zhirui Liu , Wuhong Li, Zhenyu Zhu and Yifeng Chai*,示例：应用亲水作用色谱-反相色谱互补策略联用飞行时间质谱检测器鉴别冠心宁注射液的主要成分,研究背景,2009年7月，SFDA针对近年来中药注射剂频发质量安全事故这一问题，下发了《关于开展中药注射剂安全性再评价工作的通知》，要求在全国范围内开展中药注射剂安全性再评价工作，并提出了如下要求： 全面开展生产及质量控制环节的风险排查，切实控制中药注射剂安全隐患 因此，将注射液中绝大多数甚至全部成分搞清楚是，并进行针对性的质量控制，是保证中药注射液安全稳定的基础。

研究背景,冠心宁注射液：收载于卫生部部颁标准（1998） 由丹参和川芎两味传统中药组成； 临床上主要用于冠心病、心绞痛、脑栓塞等心、脑血管疾病的治疗； 具有扩张冠状动脉，促进冠脉侧支循环，加速缺血心肌的修复等作用；,注射液中主要成分为酚酸类、苯酞类等水溶性成分，——这是通常认为的起作用成分,,糖、氨基酸、有机酸等成分同样也起到一定的作用，辅料的含量也应得到控制，但由于这些物质极性均较强，很难在常规的C18柱上表征色谱条件：,RPLC分离使用Agilent Zorbax SB-C18柱(100 mm × 3.0 mm I.D., 3.5 µm)，柱温30℃，流动相使用0.4%乙酸水溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脱0-19 min，2-23 % B；19-27 min，23-30 % B；27-35 min，30-90 % B；35-45 min，90%B流速0.5mL/min，为了获得更好的电喷雾效率，柱后分流保持0.2mL/min进入质谱分析，进样量为5μL HILIC分离使用SHISEIDO PC HILIC柱(150mm × 2.0 mm I.D., 5 µm)，柱温40℃，流动相使用5mmoL/。