布鲁氏菌病实验室诊断技术.ppt

布鲁氏菌病实验室诊断技术,概 述,布氏菌（Brucella）是一个重要的人兽 共患病病原菌，该菌侵入人或动物后可引起 人兽共患的传染—变态反应性疾病，即布氏 菌病（Brucellosis，简称布病），是我国规 定报告的乙类传染病布病存在于全球200多 个国家和地区，是全球特别是发展中国家面 临的重要的公共卫生问题实 验 室 检 查,病原学检查：病原的分离是确 诊布病最可靠的方法 病原学检查包括布氏菌的分离 培养（血培养、骨髓培养）、鉴定,特异性血清学诊断技术,平板凝集试验 虎红平板凝集试验 试管凝集试验 补体结合试验 抗球蛋白试验 含巯基化合物处理血清后凝集试验,虎红平板凝集试验,虎红平板凝集试验(RBPT)中所用的抗原是 酸化性（PH=3.6~3.9）带色抗原，与被检血 清作用时能抑制血清中IgM类抗体凝集活性 检查出的抗体是IgG类虎红平板凝集试验,1 检验目的、对该病的诊断意义 采用虎红平板凝集试验（RBPT）试验主要目的是排除某些非特异性凝集及某些其它细菌共同抗原与抗布氏菌血清出现的交叉反应，是一种快速、简便而有效的实验该法多用于大规模筛选 2 样品（标本）采集要求及采样量 用灭菌注射器无菌操作采取静脉血5ml置于无菌一次性采血管内，置斜面，分离血清。

虎红平板凝集试验,3 所需试剂、仪器设备、试验环境条件 清洁脱脂玻片或凹形孔的玻片、1ml吸管或微量加样器、微型玻璃搅棒（可用牙签替代）、虎红平板凝集抗原、被检血清 4 操作步骤 在玻片上加0.03ml被检血清，然后加入虎红平板抗原0.03ml，摇匀或用玻璃搅棒混匀，在5min内判定结果虎红平板凝集试验,5 质量控制 所用器材洁净，试剂标准，并在有效期内使用，所加剂量必须准确血清标本不得发生溶血 6 结果判定 在5min内出现可见的凝集现象为阳性反应无凝集现象出现为阴性 7 工作时限要求 个案病例，送检材料2日内完成，大批量样本不得超过7日如全血不能及时分离血清，可冷藏4°C保存，但保存期不得超过3日血清可冷冻保存，保存期不得超过2月虎红平板凝集试验,优点 简便、快速、易掌握，敏感性较好 可作为筛查试验；经济、方便,观察结果需在自然光状态下,试管凝集试验,试管凝集试验（SAT）的应用已有近百年历史，国内外成功地应用到人、畜间布鲁氏菌病的诊断上实践证明该试验时一种简便异形，有一定特异性和敏感性的布病诊断方法凝集试验的阳性反应多数出现在病后1-2周，间隔1-4周后抗体效价增高4倍及以上时，提示为近期感染。

试管凝集试验,SAT是一种特异、较敏感、稳定的检测方 法，可以检测人、畜血清中的抗布鲁氏菌 IgG、IgM、IgA 3类免疫球蛋白，且SAT检测 IgM的敏感性较高，因此可作为布鲁氏菌病的 早期诊断，同时又可用于布鲁氏菌病疫苗免疫 后血清抗体的检测 SAT试验操作简便，判定容易，因此有广 阔的应用前景试管凝集试验,样品（标本）采集要求及采样量 用灭菌注射器无菌操作抽取静脉血5ml、3000转/分离心15min分离血清备检 器材及试剂 试管凝集抗原、被检血清、阳性血清、 稀释液（0.9%生理盐水） 1ml、 10ml 吸管、试管架、37 ℃温箱、离心机等,试管凝集试验,抗原的 稀释,试管凝集试验,抗原的稀释：将试管凝集抗原充分混匀后， 用0.9%生理盐水做10倍稀释，备用 标准比浊管的制备：为了判定结果准确，应 制备凝集反应标准比浊管，作为判定透明程 度的依据，其配制方法如下：取凝集反应稀 释后的抗原液再作对倍稀释，即2ml稀释抗原 再加2ml盐水，混合后按下表配制试管凝集反应标准比浊管配制,“++++”液体完全透明，菌体呈伞状沉淀或块状颗粒状沉淀，呈100%凝集； “+++” 液体近于完全透明，菌体呈伞状沉淀，呈75%凝集； “++” 液体略微透明，菌体呈较薄伞状沉淀，呈50%凝集； “+” 液体不透明，管底有不很明显的伞状沉淀，呈25%凝集； “-” 液体不透明，无伞状沉淀。

[注]：效价：以产生 50%凝集的(++凝集程度)血清最高稀释倍数为受检血清的效价试管凝集试验,被检血清： 1、每份血清取9支小试管，放于试管架上 2、血清稀释：第一只管加生理盐水2.4ml，第二只不加，第三只到第九只管各加0.5ml盐水然后用1ml吸管取被检血清0.1ml加入第一管中，混匀后吸1ml加入第二、三管各0.5ml，第三管混匀后再吸0.5ml加入第四管，以此类推到第八管吸0.5ml弃掉试管凝集试验,3、 加入抗原：取出之前稀释好的试管凝集抗原，然后从第二管开始每管加入0.5ml，加入抗原之后，血清的最终稀释倍数为从第二管开始1：50、1：100、1：200、1：400……1:1600，第一管为血清对照然后充分混匀，放于37℃温箱中18-20小时后取出，在室温下放置1-2个小时观察结果试管凝集试验,阳性对照：加入1ml的生理盐水使其溶 解（充分溶解使阳性血清的效价发挥 到最大），稀释、加入抗原（方法、步 骤同被检血清样本的操作）试管凝集试验,结果判定： 血清对照为清亮透明无沉淀，抗原对照为均匀浑浊，两种对照管成立，才可判定试验管，否则重做 人感染布鲁菌的诊断标准：1：100(++)及以上者为阳性，1：50(++)为可疑。

试管凝集试验,影响试验结果的因素及注意事项： 1、受检血清应新鲜、无溶血、无污染，存放血清处温度不 能超过10℃，采血后应于3—4日内进行检查，因放置时 间过长可能会导致血清效价降低 2、遵守操作规程：所用的器材要清洁、干燥，试剂的加量一定要正 确，放入温箱的温度和时间都要按要求，否则都影响结果 3、作凝集反应时，有个别血清会出现前带现象，即稀释度低的血清 管内（或血清量多的格）不发生凝集，而稀释度高的管内（或血 清量少的格）出现凝集，这叫做前带现象如果某血清在平板凝 集反应中出现了前带现象，那么做试管反应时应多做几个管，多 采用几个稀释度试管凝集试验,影响试验结果的因素及注意事项： 4、血清或抗原中含有过多的防腐剂，阻止或妨碍了抗原的凝集 5、氯化钠的含量增高对血清反应有明显的影响，盐的浓度越高，反应的敏感性提高，因此在兽医界为了克服凝集反应中的阻抑抗体的干扰，对羊血清采用高渗盐水作凝集反应，一般浓度在10~12%，切记人血清不能用高渗盐水（ 10% ） 6、前带现象产生的原因 胶体粒子学说：血清稀释度低所含的胶体粒子多，它影响抗原抗体的结合，而稀释度高的则含胶体粒子少，所以出现凝集。

不完全抗体学说：血清中因存在不完全抗体竞争抗原，所以在低稀释度的管中不凝集 抗原抗体比例失调，也就是抗体过剩或血清内含有过多防腐剂，严重污染可造成前带现象的产生，封闭抗原的干扰试管凝集试验,评价： 该方法简便、易操作，适用于各实验室应用 该方法特异性较好，敏感性也高，因此适用于检疫和临床诊断 有材料报道，人感染布氏菌后常于发烧的第一天起就开始出现抗体，随着体温的增高效价升高，因此该方法可做为早期诊断布氏菌病的方法，也可做为判定疾病的活动期 该方法凝集反应的强度与布氏菌培养的阳性结果成正比，凝集价越高细菌培养的阳性就越高，和发烧呈正比，一般来说，体温高凝集价也增高 由于该试验有时出现前带现象和封闭现象，所以有时也出现假阴性结果，必要时和其它方法联合应用,。