桔实皮中橙皮苷的提取测定及对自由基清除作用的研究的论文.docx

桔实皮中橙皮苷的提取测定及对自由基清除作用的研究的论文　　陈建秋，胡志军， 王南溪， 沈卫阳　　【摘要】 　　目的优化分光光度法测定橙皮苷含量的实验方法和桔实中双氢黄酮类橙皮苷的提取工艺方法分析方法：采用l9 (34) 正交实验, 考察溶剂类型、显色时间、温度和显色剂用量等影响因素；提取工艺：采用l9 (34) 正交实验, 考察乙醇浓度、溶剂用量、提取时间和提取温度等影响因素；参照fenton反应原理研究不同桔实中黄酮的清除·oh中作用结果分光光度法测定橙皮苷含量的最佳实验条件：橙皮苷与5% al(no3)3溶液（m:v），在20 ℃反应20 min，最大吸收波长为400 nm；橙皮苷提取的最佳工艺条件： 70%乙醇为提取溶剂，采用料液比1∶20（m∶v）,在50 ℃下中速搅拌提取3 h桔实中黄酮提取液对fenton体系产生的·oh有一定的清除能力结论优选得到的提取工艺提取不同桔实中的橙皮苷，发现橘皮中橙皮苷含量最高　　【关键词】 橙皮苷； 提取工艺； 正交实验； 含量测定； 自由基清除　　abstract：objectiveto study the determination method of hesperidin content by spectrophotometer and extraction technology of hesperidin from peels of technology: the type of solvent, temperature, quantity of indicator and the time of reaction were investigated through orthogonal tests of l9 (34)； extraction technology: the concentration of ethanol, quantity of ethanol, time and temperature of extraction were investigated through orthogonal tests of l9 (34). in addition,the scavenging effect of flavanone from peels of citrus on hydroxyl radical was optimum technical conditions for determining the content of hesperidin by spectrophotometer were that: hesperidin was immersed with 5% al(no3)3（m:v）at 20℃ for 20 min and the maximum absorbance wavelength was 400 nm； the optimum technical conditions of extracting hesperidin were that: 70% ethanol was used as solvent, and the hesperidin was extracted at 50℃ for 3 h when the powers was stirred at medium-speed ,the mass ratio of peels weight to 70% ethanol solution was 1:20（m:v）.in addition,total flavanone from peels of citrus had effects on scavenging of hydroxyl radicals. conclusionthe content of hesperidin in peels is the highest by improved extraction technology.　　key words：hesperidin； extraction； orthogonal tests； determination； scavenging of hydroxyl radicals　　橙皮苷（hesperidin）即柑桔素- 7 - o - 新橙皮糖苷,分子式c28h34o15，属双氢黄酮类化合物,主要存在于柑、橘、甜橙和柠檬等的果皮中。

纯品为白色细树枝状针形晶体，熔点258～262℃，2％吡啶溶液中比旋光度为-76°，相对分子量为橙皮苷是构成vp的主要成分，有保护毛细血管，降低毛细血管的脆性，防止微血管破裂出血的作用，作为医药工业用作治疗高血压病和心肌梗塞的药物被广泛使用［1～3］橙皮苷不溶于乙醚、苯、丙酮及氯仿，难溶于水，微溶于乙醇、甲醇，可溶于吡啶、甘油、稀碱溶液,常用的提取方法有溶剂提取法、碱提酸沉法、超声波提取法、微波提取法和酶解法［4］，其中溶剂提取法和碱提酸沉法操作简单而经济，提取率也较高橙皮苷结构式中存在3-羟基、c-4位羰基能与三氯化铝或硝酸铝生成黄色络合物，可用分光光度法检测［4］本研究分别对橙皮苷络合物的显色条件和橙皮苷溶剂浸提工艺进行了优化，并在此基础上，测定了不同桔实中橙皮苷的含量，为工业生产企业挑选原材料提供依据同时，对不同桔实提取液进行了羟自由基清除作用的研究　　　1 仪器与材料　　仪器bs124型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；hd型恒温水浴锅（上海分析仪器厂）；shb-ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；uv-9100紫外/可见分光光度计（北京瑞利分析仪器有限公司）；研磨机（上海灿坤实业有限公司）。

　　试剂盐酸(37%，南京化学试剂有限公司)；乙醇(%，南京化学试剂有限公司)；七水合硫酸亚铁（%，广东·汕头市西陇化工厂）；水杨酸（%，南京化学试剂有限公司）；氢氧化钠(%，南京化学试剂有限公司)；硝酸铝（%，南京化学试剂有限公司）；30%过氧化氢（南京化学试剂有限公司）以上试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水　　分别将试剂配成如下使用液：氢氧化钠溶液（ mol/l）；稀盐酸（体积分数7%）；al(no3)3溶液（质量体积分数5%）；乙醇：(体积分数100%，70%，40%)；硫酸亚铁溶液（/l）；过氧化氢溶液（/l）；水杨酸-乙醇溶液（/l）　　供试药橙皮苷标准品（98%，西安小草植物科技有限公司提供）；橘皮、贡桔皮、甜橙皮、芦柑皮、青橙皮、柠檬皮、佛手皮（均为市售），将上述7种鲜果皮自然风干，分别粉碎后密封备用　　2 方法与结果　　分光光度法测定橙皮苷含量的实验条件优化　　橙皮苷标准溶液的制备准确称取橙皮苷标准品，在超声波作用下于无水乙醇中完全溶解并定容至100 ml,橙皮苷储备液浓度为200 μg/ml　　最大吸收波长的测定橙皮苷在al(no3)3的蒸馏水体系中，于80 ℃反应15 min后形成黄色络合物，测其最大吸收波长［5］。

准确移取 ml橙皮苷储备液于10 ml比色管中，加入 ml 5%的al(no3)3溶液，于80 ℃水浴中加热15 min后，加入蒸馏水定容至10 ml，以试剂做空白，测定不同波长下的吸光值，如图1所示橙皮苷的最大吸收波长为400 nm　　正交设计及测定结果分光光度法测定橙皮苷络合物的吸光度，对显色反应影响较大的因素主要有：溶剂类型、ph值、显色时间、温度和显色剂用量［6，7］，本实验采用正交筛选法选出最佳的实验条件，各因素水平见表1所设计分别移取橙皮苷使用液0，，，，， ml置于10 ml比色管中，按照表2所设条件，加入相应al(no3)3溶液后，用相应的溶剂定容，配成浓度分别为0，，，，， μg/ml的使用液，显色后在400 nm下测吸光度,重复3次，取其平均值,绘制曲线可得吸光度a与橙皮苷浓度c(μg/ml)的线性回归方程表1 正交因素水平，表2 l9（34）正交实验及结果（略）　　实验结果与讨论根据表2极差可得，上述4种因素的主次顺序为： c ＞a ＞d ＞b，本实验最好的线形条件是a3b1c1d3，即以蒸馏水为显色体系，加入5%（m:v）的al(no3)3溶液 ml,在20 ℃反应20 min，得到的标准曲线图2所示，其线性回归方程为：a=，r= 7 ，说明橙皮苷的浓度c在～ μg/ml浓度范围内与吸光度a之间有较好的线性关系。

　　加样回收率实验取同一批橘皮样品4份，分别加入橙皮苷标准品，按供试品制备，测其吸光度，计算得回收率为%～103%，平均回收率101%，rad=%(n=4)，结果如表3所示表3 样品橙皮苷加标回收实验试验号样品含量c/μg·ml-1加入量c/μg·ml-1测得值c/μg·ml-1回收率（略）　　橙皮苷提取实验条件优化　　橙皮苷提取工艺流程准确称取5 g左右干橘皮粉与相应料液比的不同浓度的乙醇溶液，置于装有回流装置的圆底烧瓶中，在相应的温度下保温一定时间后，过滤得橙皮苷滤液，取其滤液测定其吸光度由于橙皮苷样品未经脱色，本身有杂质黄色，在测定时设置试剂空白作对照，用总吸光度减去非黄酮类物质在400 nm处的吸光度　　正交设计与结果测定影响橙皮苷提取效果的主要因素有浸提剂浓度、料液比、浸提温度、浸提时间等，按以上确定的条件结合参考文献，采用表4所示的正交实验因素水平表，做4因素3水平的正交实验［8～10］，实验结果如表5所示表4 正交因素水平，表5 l9（34）正交实验与结果实验号a乙醇浓度（略）　　正交实验结果分析由表5中极差r项可知，上述4种影响因素的主次顺序为：b ＞d ＞a ＞c,本实验最佳浸提条件是a2b1c1d2，即以70%乙醇为提取溶剂，采用料液比1∶20（g:ml）,在50 ℃下提取3 h，测定吸光度，得到橘皮中橙皮苷含量为%。

　　浸提加搅拌提取法采用浸提加搅拌提取法，以与浸提法相同的实验条件：以70%乙醇为提取剂，料液比为1∶20（g:ml），在50 ℃下保温3 h，同时中速搅拌粉末，测定吸光度，得到橘皮中橙皮苷含量为%结果证明，在浸提过程中加以搅拌操作，可有效提高橘皮中橙皮苷的提取率　　不同桔实中橙皮苷含量测定　　橙皮苷提取工艺准确称取不同桔皮粉末5 g和100 ml 70%乙醇溶液置于装有回流装置的圆底烧瓶中，在50 ℃下提取3 h，同时中速搅拌定容至100 ml容量瓶中（c样品质量/提取液体积=50 mg/ml），测定不同桔皮中橙皮苷的含量　　实验结果　　经实验测得不同桔实皮中橙皮苷含量如表6所示表6 不同桔实皮中橙皮苷含量（略）　　桔实皮中黄酮类物质清除·oh的研究　　实验方法参照fenton反应原理及李贵荣［11］的方法改进后进行测定利用h2o2与fe2+混合产出·oh,但由于·oh具有很高的反应活性，存活时间短，若在反应体系中加入水杨酸，就能有效地捕捉·oh，并产生有色物质反应如下：　　h2o2+ fe2+→fe3++·oh+oh-　　此产物在508nm处有强吸收，若在此反应体系中加入具有清除·oh功能的被测物，被测物便会与水杨酸竞争·oh，从而使有色物质生产量减少。

将配制好 nmol/l硫酸亚铁溶液、 nmol/l过氧化氢溶液、 nmol/l水杨酸-乙醇溶液、一定浓度的不同桔实提取液，按表7的顺序加入到10 ml的比色管中，加蒸馏水至刻度，振荡静置10 min后以蒸馏水为参比，于508 nm处测吸光度值，代入公式计算清除率其计算公式为：　　清除率（%）=［a对照-（a样品-a0）］/a对照×100%　　式中：a对照为没有加样品的吸光值；a样品为加样品的吸光值；a0为没有加显色剂的吸光值表7 ·oh实验加样（略）　　实验结果不同桔实中黄酮类物质对·oh清除作用实验结果见表8表8 不同桔实提取液对羟自由基的清除作用（略）　　3 小结　　　　本文通过正交实验的研究。