
第九章DNA序列测定.ppt
33页第九章 DNA序列测定第一节 概 述一、DNA序列测定 即核酸DNA分子一级构造的测定,是现代分子生物学一项重要的技术 1963年,Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个氨基酸的序列测定,这在当时来说是一件了不起的大事70年代后期,Sanger和Maxam-Gilbert等人又建立了核酸序列测定的方法,Sanger双脱氧末端终止法和Maxam-Gilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读阶段,使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易,这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列二、二、DNADNA序列测定工作原理序列测定工作原理 在四种反响体系中,寡聚核苷酸分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基,将待测DNA片段转变成一系列放射性核素标记的单链DNA片断,并使其一端为一固定的末端,而另一端由于长度不同,成为一系列相差1个碱基的连续末端经电泳别离,放射自显影,可直接读出DNA的序列三、核酸序列分析的目的意义和策略详细方法一序列分析的目的,一序列分析的目的,2 2种:种: 1 1、确证性测序、确证性测序 通过测定对突变进展定位和鉴定,应用时测定野通过测定对突变进展定位和鉴定,应用时测定野生型基因上同源区和突变体的相应序列直接在一张胶片上比较二者序列生型基因上同源区和突变体的相应序列直接在一张胶片上比较二者序列差异。
基因序列差异基因序列 2 2、从头序列、从头序列 目的是提供一段目的是提供一段DNADNA准确的核苷酸序列未知基准确的核苷酸序列未知基因序列因序列二测定在生物医学领域相应应用,二测定在生物医学领域相应应用,2 2个方面:个方面: 1 1、对基因序列检查,特别是有遗传倾向的病例检测相关基因有无、对基因序列检查,特别是有遗传倾向的病例检测相关基因有无突变,有助于说明疾病发病机理及建立相应诊疗方案突变,有助于说明疾病发病机理及建立相应诊疗方案 2 2、对已经克隆的未知序列进展测定,从而说明该基因的一级构造、对已经克隆的未知序列进展测定,从而说明该基因的一级构造,如人类基因组方案中大量的工作是要说明克隆片段的核苷酸的排列顺,如人类基因组方案中大量的工作是要说明克隆片段的核苷酸的排列顺序三序列分析的策略详细方案三序列分析的策略详细方案 测序目的不同或靶测序目的不同或靶DNADNA片段大小有区别,那么序列分析的详细方案片段大小有区别,那么序列分析的详细方案有所不同,所以测序之前应根据相应情况制订序列测定的策略,这个问有所不同,所以测序之前应根据相应情况制订序列测定的策略,这个问题在后面将涉及到,但由于学时限制,不可能完全展开来讲,请同学参题在后面将涉及到,但由于学时限制,不可能完全展开来讲,请同学参看相关书籍。
看相关书籍四、测序的常用方法DNADNA序列测定常用方法有如下序列测定常用方法有如下3 3种:种: 1、末端终止法2、化学裂解法3、DNA测序自动化使用特异性引物与单链模板DNA退火,在DNA聚合酶作用下进行延伸反应,用ddNTP终止,用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA,从而完成测序的方法用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段,产生一簇各种长度的短链,经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序类似末端终止法,所不同的是用荧光染料标记,计算机自动读出优点简便、迅速、应用广泛不需酶促反应,可以对寡核苷酸测序1、高负荷,1块胶可测16个样品;2、机读不需放射自显影;3、安全不用同位素;4、简单迅速8-10h 不管是上述哪一种方法,测序根本过程如下: 1、制备待测DNA序列模板; 2、酶促或化学反响将其转变“等差数列n=1; 3、PAGE; 4、读序P255,图10-2五、测序的根本过程五、测序的根本过程六、测序技术的最近开展六、测序技术的最近开展 1、商品化测序试剂盒 解决了质粒问题,节省了时间,但缺乏灵敏性 2、自动化测序仪 以酶学测序反响或和放标测序产物为根底,微机处理。
3、热循环测序 使极少数测序产物线性放大 4、测序商品化 60.-180.¥,搞定七、七、DNADNA序列测定的应用序列测定的应用分析基因组核苷酸排列序列分析基因组核苷酸排列序列分析基因序列分析基因序列基因定点诱变的根底基因定点诱变的根底 基因工程载体构建中基因工程载体构建中DNADNA序列定位和排序的根底序列定位和排序的根底确定确定DNADNA序列中蛋白质的编码区序列中蛋白质的编码区第二节 Sanger双脱氧末端终止法一、原 理一一DNADNA复制的复制的4 4个根本条件个根本条件 1 1、ssDNAssDNA模板模板 2 2、DDDPDDDP 3 3、带有、带有3-OH3-OH末端的单链寡核苷酸引物末端的单链寡核苷酸引物 4 4、4 4种种dNTPdNTP二链终止剂二链终止剂chain-reminatorchain-reminator-2-2,3-3-二脱氧核糖核酸酶二脱氧核糖核酸酶 当当3-OH3-OH由于脱氧或被取代,下一个核苷酸不能通过由于脱氧或被取代,下一个核苷酸不能通过55磷酸形成磷酸形成33,55磷酸二酯键,使链的延伸反响终止在这个异常的核苷酸处假设用一磷酸二酯键,使链的延伸反响终止在这个异常的核苷酸处。
假设用一样的样的4 4组引物组引物- -模板混合物,每一组加模板混合物,每一组加4 4种种dNTPdNTP,其中,其中1 1种用种用32P32P或或35S35S标记,加标记,加1 1种种ddNTPddNTP,每组将产生一种特异性的以,每组将产生一种特异性的以ddNTPddNTP为末端的不为末端的不同长度的核苷酸链,经同长度的核苷酸链,经PAGEPAGE别离,即可读出被测定的全部顺序别离,即可读出被测定的全部顺序dNTPdNTP和和ddNTPddNTP竞争结合底物竞争结合底物P255P255,图,图10-210-2三三 Sanger Sanger双脱氧链终止法的原理双脱氧链终止法的原理 在DNA合成时,利用ddNTP与dNTP竞争掺入到新生的DNA链上使链终止的原理即在A、C、G、T 4种反响体系中,分别参加不同的ddNTP,其他试剂一样,经酶促合成反响,生成具有一样的5末端,而3不同的DNA片段的混合物经电泳别离,放射自显影,直接读出DNA的核苷酸序列二、试 剂一引物一引物 酶促测序反响中利用一个与模板特定序列互补的合成寡酶促测序反响中利用一个与模板特定序列互补的合成寡核苷酸作为核苷酸作为DNADNA合成的引物。
合成的引物 在许多情况下可将靶在许多情况下可将靶DNADNA片段克隆于片段克隆于M13M13噬菌体或噬菌噬菌体或噬菌粒载体,以获得单链粒载体,以获得单链DNADNA分子作为模板也可用分子作为模板也可用SangerSanger法测法测定变性双链定变性双链DNADNA模板序列如变性质粒模板序列如变性质粒DNADNA以上两种情以上两种情况都可以采用能与位于靶况都可以采用能与位于靶DNADNA侧翼的载体序列相退火的通用侧翼的载体序列相退火的通用引物,不必获得与未知引物,不必获得与未知DNADNA序列互补的引物序列互补的引物M13M13噬菌体重噬菌体重组子的通用测序引物一般长组子的通用测序引物一般长15-29bp15-29bp,与紧靠,与紧靠M13mp18M13mp18多克多克隆位点区的隆位点区的HindIIIHindIII或或M13mp19M13mp19多克隆位点区多克隆位点区EcoRIEcoRI位点的序位点的序列互补这些引物同样也可用于列互补这些引物同样也可用于PUCPUC质粒的质粒的DNADNA进展进展“ “双链双链测序,并且已经商品化测序,并且已经商品化二模板二模板 纯单链纯单链DNADNA和经过热变性或碱变性的双链和经过热变性或碱变性的双链DNADNA都可以都可以用作用作SangerSanger法测定的模板。
模板的质量和所用的法测定的模板模板的质量和所用的DNADNA聚合聚合酶的种类是至关重要的酶的种类是至关重要的 通常采用通常采用M13M13噬菌体颗粒别离到的单链噬菌体颗粒别离到的单链DNADNA模板效果模板效果最正确,用变性双链最正确,用变性双链DNADNA作模板那么难获此效果小量制作模板那么难获此效果小量制备质粒备质粒DNADNA常被寡核苷酸小分子,核糖核苷酸及常被寡核苷酸小分子,核糖核苷酸及DNADNA聚合聚合酶抑制剂所污染,前两者可被用作随机引物,造成假象和酶抑制剂所污染,前两者可被用作随机引物,造成假象和强终止现象,使测序胶模糊不清采用小量制备质粒强终止现象,使测序胶模糊不清采用小量制备质粒DNADNA测定未知测定未知DNADNA克隆片段的序列,并不可取,假设用克隆片段的序列,并不可取,假设用CsCl-CsCl-溴溴化乙锭梯度离心结果纯化质粒化乙锭梯度离心结果纯化质粒DNADNA,测序结果会好得多,测序结果会好得多,但又消耗大量的人力和物力但又消耗大量的人力和物力DNADNA序列测定模板制备方法序列测定模板制备方法 因为因为DNADNA是相当大的分子,一般由几是相当大的分子,一般由几kbkb组成,最小的组成,最小的质粒和病毒也在质粒和病毒也在1kb1kb以上,而测序的最好方法,一次也只以上,而测序的最好方法,一次也只能测几百个能测几百个bpbp以以300-500bp300-500bp为好,为好,300bp300bp最正确,所最正确,所以测序前,可以用以测序前,可以用2 2种限制酶消化待测种限制酶消化待测DNADNA,使其降解成,使其降解成小片段,用琼脂糖凝胶电泳别离回收。
回收片段,假设超小片段,用琼脂糖凝胶电泳别离回收回收片段,假设超过过700-800bp700-800bp,那么进展第二次限制酶消化,再次别离回,那么进展第二次限制酶消化,再次别离回收然后分别测定每个片段的顺序由于两种限制酶在收然后分别测定每个片段的顺序由于两种限制酶在DNADNA链上的切点位置不同,产生的片段之间有交织重叠顺链上的切点位置不同,产生的片段之间有交织重叠顺序,据序,据2 2片段的这种末端重叠现象,用计算机定出各片段片段的这种末端重叠现象,用计算机定出各片段的位置,而排出的位置,而排出DNADNA的全部序列的全部序列 在测序中,小片段在测序中,小片段DNADNA只需直接克隆到只需直接克隆到M13mpM13mp或者质或者质粒载体中,进展双链或单链模板测序如今常用的粒载体中,进展双链或单链模板测序如今常用的M13mpM13mp载体一般是成对设计,如载体一般是成对设计,如M13mp18M13mp18与与M13mp19M13mp19都有一样都有一样的多克隆位点,但方向相反同一待测的的多克隆位点,但方向相反同一待测的DNADNA片段分别克片段分别克隆到这两个载体中,用一通用引物进展测序。
对于数隆到这两个载体中,用一通用引物进展测序对于数kbkb大大片段片段DNADNA分子,那么有几种策略,如定向克隆,内部片段分子,那么有几种策略,如定向克隆,内部片段克隆,原位亚克隆,包含上述用克隆,原位亚克隆,包含上述用2 2种限制酶消化种限制酶消化DNADNA等1 1、用噬菌体、用噬菌体M13M13克隆待测克隆待测DNADNA片段片段 1 1噬菌体噬菌体-是寄生在细菌的病毒存在是寄生在细菌的病毒存在3 3种状态,有尾种状态,有尾2020面体,无尾面体,无尾2020面体和丝状单链噬菌体面体和丝状单链噬菌体filamentousfilamentous,M13M13是一类雄性特异的大肠杆菌噬是一类雄性特异的大肠杆菌噬菌体,含单链环状的菌体,含单链环状的DNADNA它感染细菌宿主菌呈溶原状态生长,在菌体它感染细菌宿主菌呈溶原状态生长,在菌体内形成过渡阶段双链环状复制型内形成过渡阶段双链环状复制型DNADNAReplicative form DNAReplicative form DNA,RF DNARF DNA,在适当的条件下,可以扩增至数百个拷贝成熟的噬菌。












