透明质酸论文.docx

透明质酸的分离纯化摘要：1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该 物质透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理 功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转， 促进创伤愈合等尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的 自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，对于其的利用越来越 多，为此通过改善其提取纯化方法成为众多微生物科学家研究的课题方向关键字：透明质酸，分离提取，纯化1. 透明质酸介绍透明质酸是一种酸性粘多糖，是一种高分子的聚合物白色絮状或无定形固 体，无臭无味，具有吸湿性溶于水不溶于有机溶剂是由单位D-葡萄糖醛酸 及N-乙酰葡糖胺组成的高级多糖°D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之间由P -1,3-配糖键相连，双糖单位之间由P -1,4-配糖键相连分子量具有不均一性，一般平均为500—2000kD，结构式为广泛存在于人或动物的各种组织中，已从结缔组织、脐带、皮肤动脉等材料 中分离得到，在哺乳动物体内，以玻璃体、脐带和关节滑液含量最高透明质酸 是一种多功能基质，透明质酸HA广泛分布于人体各部位。

其中皮肤也含有大量 的透明质酸人类皮肤成熟和老化过程也随着透明质酸的含量和新陈代谢而变 化，它可以改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老， 在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂与其他营养成分配合使用，可以起到 促进营养吸收的更理想效果具有特殊生理功能和作用，如润滑作用、保水作用 等，临床上作为黏弹剂用作眼科手术辅助剂，作为润滑剂用于治疗关节病，还用 于促进创伤愈合,用作化妆品中的保湿剂等2. 透明质酸种类透明质酸的生产过程和技术决定了质量优劣的差异，所以在使用上一定要是 正确来源生产的产品才能有治疗的功效.一般而言,提炼的方法有三种：1、 动物组织:主要原料是鸡冠和牛眼玻璃体等.用丙酮或乙醇将原料脱脂、 脱水,用蒸馏水浸泡、过滤，然后以氯化钠水溶液和氯仿溶液处理，之后加入胰蛋 白酶保温后得到混合液,最后用离子交换剂进行处理、纯化得到精制的透明质酸. 这种方法提取率极低，仅1%左右,分离过程复杂，致使透明质酸价格昂贵，达5000 美元/公斤，限制了在化妆品中大的量使用.2、 微生物发酵：以葡萄糖作为碳源发酵液.在培养基中发酵48小时,发酵结 束后，过滤除去菌丝体和杂质，然后用醇沉淀法等简单操作即得到高纯度的产物. 采用发酵法制造的透明质酸，优点是能按商品设计来设定分子量大小.发酵法的 关键在于菌种的选择，多选用链球菌、乳酸球菌类等.3、 化学合成:采用天然酶聚合反应;首先使用多糖类聚合物合成“透明质酸 氧氮杂环戊烯衍生物”，然后添加水分解酶，制造出衍生物和酶的复合体,最后在 90度摄氏反应液中清除其中的酶，就合成了透明质酸.采用人工合成法可大大降 低透明质酸的制造成本，但结构较不精纯.同样是透明质酸的产品，因为原料来源及制成技术的差别，对效果有明显的 影响.产品的浓度不能作为选择产品的参考，纯度、分子量、3D立体结构才会直 接影响透明质酸的吸水效果.通常分子量愈大、网状结构愈完整，有最好的吸水效 果.坊间保养品、化妆品盛行，但许多业者自制的透明质酸，便宜，可是不一定有效 果.甚至有人推行的口服的透明质酸,经过肠胃吸收之后会分解成醺类及氨基酸 的小单位分子，还是必须透过自体合成等复黔步骤才能生成在皮肤、结镳组织中, 其效果也必须要打折扣.3. 透明质酸功能透明质酸的主要功能有如下三点:1、改善关节功能2、 天然的保湿润滑剂3、 防止动脉硬化、脉搏紊乱和脑萎缩等病症的发生。

透明质酸本身带有负电荷，在动物体存在于大部分的软结缔组织它的水溶 液为粘弹性流体，填充在细胞与胶原纤维空间之中且覆盖在某些表皮组织上在 动物体，其主要功能乃保护及润滑细胞，调节细胞在此粘弹性基质上的移动，稳 定胶原网状结构及保护它免于受到机械性的破坏因为透明质酸为天然性润滑以 及吸震高分子，在肌腱、肌腱鞘及粘滑膜表面作为润滑剂透明质酸HA广泛分 布于人体的结缔组织中，在牛眼玻璃体、关节腔中几乎以纯态形式存在存在于 皮肤中的透明质酸HA，对人体表皮的新陈代谢起到重要的作用人体中透明质 酸）HA的破坏或失调，均可造成疾病皮肤中透明质酸HA含量的减少及破坏， 可造成皮肤失水中，起皱而失去弹性，使人表皮衰老，因而，透明质酸HA又被 称为抗衰老因子透明质酸HA是人皮肤表皮及真皮的主要基质成分之一，其生 理功能是能使水分进入细胞间隙，并与蛋白质结合而形成蛋白凝胶，将细胞粘在 一起，发挥正常的细胞代谢作用，起到保持细胞水分，保护细胞不受病原菌的侵 害，加快恢复皮肤组织，提高创口愈合再生能力，减少疤痕，增强免疫力等作用 同时，透明质酸是增殖细胞和迁移细胞胞外基质的主要成分，尤其在胚胎组织中 是如此因为透明质酸的自身的特性，能使细胞保持彼此分离，使细胞易于运动 迁移和增殖并阻止细胞分化。

在发育过程中，透明质酸的作用似乎是防止细胞在 增殖够数或迁移到位之前过早进行分化在医药方面，透明质酸HA用于非甾体 消炎药，关节炎治疗，眼科，心外科手术的辅助药品，在治疗烫伤、烧伤、冻伤、 人造皮肤等方面，有着独到的作用4. 透明质酸制备流程：从不同原料制备透明质酸，其分离纯化方法不同，本例发酵法制备透明质酸 发酵液一预处理一分离一纯化一干燥一纯品4.1摇瓶种子液的培养取斜面菌种（HF-1191链球菌），接种于装有灭菌培养液400ml的1L锥 形瓶中，37°C培养12~16h，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种 于种子罐中4.2种子罐种子液的培养按摇瓶种子液的配方配制培养液100L，加入种子罐中，通蒸汽加热， 115°C灭菌30min冷却至37°C,用火焰接种法，将摇瓶种子液接种于种子罐 中，通气量50L/min，搅拌转速120r/min，37C培养12~16h光镜观察具体 生长良好，无杂菌污染，即可待接种于发酵罐中4.3发酵按摇瓶种子液配方，将葡萄糖含量提高到5%，配制发酵培养液1000L加 入发酵罐中，通入蒸汽加热，115C灭菌30min冷却至37C后，将种子罐中 的种子液通过移种管道移至发酵罐中，维持通气量500~600L/min，搅拌转速 120r/min，37C发酵40~46h。

在发酵过程中，发酵液的pH不断下降，加5mol/L 氢氧化钠溶液（浸取），调pH6.5~7.0o发酵后期，葡萄糖浓度下降至0.5 以下，pH下降很慢或不再下降时，即为发酵终点4.4预处理预处理是在分离纯化前对发酵液进行灭酶、灭菌、除菌的工艺对于一 些非透明质酸缺陷型菌株发酵所得的发酵液，通过预处理可以杀灭透明质酸 酶，减少HA分子量的降低史鹏等（14）采用两种预处理方式为发酵液在 70度下保温1小时，静置5h；酸处理方式为发酵液用三氯乙酸调pH至4.5, 1h后回调至6.0，静置5h，两种预处理方式的蛋白去除率、HA得率很接近， 但酸处理的分子量降低率要低于热处理，表明酸处理能更有效的抑制透明质 酸酶的活性4.5分离板框过滤除菌体，滤液用稀氢氧化钠调pH6.0~6.5,加三倍体积95%乙醇， 沉淀出透明质酸4.6纯化4.6.1形成HA复合物沉淀沉淀用与发酵液等体积的0.1mol/L氯化钠水溶液溶解，在搅拌下，加入 过量的1%氯化十六烷基毗啶水溶液与滤液中的透明质酸发生结合沉淀，形成 HA-CPB 沉淀，4.6.2解离静置使沉淀下沉，虹吸出母液，加入0.1mol/L氯化钠液洗涤沉淀两次沉淀置于发酵液等体积的0.4mol/L氯化钠液中搅拌解离过夜，4.6.3吸附解离后的溶液经冷冻抽虑除去绝大部分CPB后，加入处理好的漂白土吸 附，以脱去溶液颜色及除去残留的蛋白核酸、CPB等杂质4.6.4沉淀经上述处理后的清夜用氢氧化钠调pH至一定值，加三倍体积95%乙醇沉 淀，立即产生大量絮状沉淀。

沉淀基本完全后，用盐酸调到中性，再静置一 段时间，待上液清后，虹吸出上液，收集沉淀4.7干燥沉淀用乙醇和丙酮脱水，真空干燥器干燥，得纯透明质酸5. 存在的问题从发酵液中分离纯化的HA往往是由多种分离纯化方法联合完成的，单一 分离纯化方法并不能达到很高的纯化程度，并且每种分离纯化方法也都存在 一定的局限性利用氯仿除菌的方法，菌体沉淀中夹带较多的HAHA回收率 低，并且氯仿具有毒性酶解纯化法有利于提高HA纯度，但同时也将新的蛋 白质引入因此，只有根据制备目标选择适宜的分离纯化方法，并对工艺过 程进行优化，才能获得高纯度、分子量的HA参考文献1. 史鹏，蔡海波，杨利，等.发酵液预处理方法对透明质酸分子量降低的影响们.中 囡医药工业杂志，2005，36(12)： 741-7432. 郭育涛，陈坚，高海军，等.发酵液中透明质酸提取的新方法【J】.无锡轻 工大学学报，2000，19(5)： 437-439.3. 凌沛学.透明质酸［MI.北京：中国轻工业出版社，2000： 11-15.4. 顾其胜王文斌，由少华，等.YY0308. 1998，医用透明质酸钠凝5. 王大为，张艳荣，沙坤.中国林蛙皮多糖类天然保湿因子的提取与鉴定【J】.吉 林农业大学学报，2002，24(6)： 99-102.6. 祝庆.兽疫链球薷NW-162型菌株透明质酸发酵及提取工艺研究时.西安：西 北大学化工系，2001.7. 邓禹，堵国成，李秀芬，等.基于发酵液特性的透明质酸提取预处理工艺明.过程工程学报，2007, 7(2)： 380-384.8周海东，倪晋仁，黄文，等•膜技术分离透明质酸发酵液可行性9. 倪杭生，李润，贺艳丽，等.透明质酸的离子交换层析纯化m.中国医药工业 杂志，2001，32(11)： 485-488.10. 洪水声，陈佳，滕利荣，等.兽疫链球菌变异株产生的透明质酸的纯化及表 征。

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