质粒DNA的提取与酶切.docx

生物化学实验报告质粒DNA的提取与酶切质粒DNA的提取与酶切一实验原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后， 质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不 变性而呈絮状，离心时可沉淀下来碱裂解法从大肠杆菌制备质粒是分子生物学研究的常规技术，碱法质粒抽提用到三种溶 液：厂 溶液I： 50 mM葡萄糖、25 mM Tris-Cl、10 mM EDTA，pH 8.0；< 溶液II： 0.2 N NaOH、1% SDS；（临用前混合）| 溶液III : 3 M醋酸钾、2 M醋酸1、溶液I的作用：对于任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH,因此选用适 当浓度和适当pH值的Tris-C l溶液加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉 积到管子底部EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制DNase的活 性和微生物生长此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率2、 溶液II的作用：NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物 细胞，碰到了碱后几乎在瞬间就会溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer （双层膜）结 构向micelle （微囊）结构的相变化所导致。

SDS也呈碱性，但如果只用SDS，达不到彻 底溶解细胞的作用，加入SDS主要为下一步做铺垫这一步操作要注意两点：第一，时 间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔 混合，不然基因组DNA也会断裂3、 溶液III的作用：SDS在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS能与蛋白质结合，平均 两个氨基酸上结合一个SDS分子，所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来溶液 中的K+置换了 SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，高浓度的盐使沉淀更完全同时， 由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀2 M的醋酸可以中和NaOH,因为长时间的 碱性条件会打断DNA基因组DNA—旦发生断裂，小于100 kb的片断，就不容易与PDS 共沉淀所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量 的基因组DNA污染这一步操作混合均匀后在冰上放置，可以使PDS沉淀更充分4、酚/氯仿/异戊醇的作用：PDS的沉淀并不能将所有的蛋白质沉淀，酚可以使蛋 白质变性，作用大于氯仿，但水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心后 酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收加入氯仿后可以增加其比重，使得酚/ 氯仿始终在下层，方便水相的回收。

还有，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提 后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应(比如限制性酶切反应)，因此 如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除而用酚/氯仿混合液进 行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶 切等反应不能正常进行异戊醇的添加，主要可以使离心后上下层的界面更加清晰，方 便水相的回收二试剂准备1 Solution I： (100ml)50mM葡萄糖25mM Tris-HCl(PH8.0)10mM EDTA10mg/100ml RNaseA2 Solution II： (100ml)0.2N NaOH1% SDS3 Solution III:(100ml) (PH5.5)3M KAc2M HAc4酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)5 70% 乙醇 100ml6 LB/amp培养基200ml(前一次实验已准备)三实验步骤1接种(实验前一晚进行)挑取单克隆，接种到LB (Ampr或Kan)液体培养基中，37° C，220r/min，O/N；吸取lml菌液于Eppendorf管中，8000 r/min离心3min,弃尽上清。

加入150p l 冰预冷的solutionI,涡旋振荡30s后置于冰上3min；加入300p l solution II,快速上下颠倒试管4-5次，置于冰上3-5 min；再加入225p l冰预冷的solutionIII,上下小心颠倒5-6次，置于冰上3-5 min；12000 r/min离心5 min取上清（约600p l）,加入等体积的酚-氯仿-异戊醇 （25:24:1），混匀；12000 r/min离心5 min取上清（约500p l）,加入2倍体积冰预冷的无水乙醇, -20° C 静置 2h 或 O/N；12000 r/min离心5min,去上清，沉淀用400p l冰预冷70%乙醇洗2-3次，吹干 沉淀；加入 15p l 含 0.5U RNAase 的 ddH2O 溶解沉淀，37° C 静置 30min, -20° C 保 存质粒酶切：向提含有质粒的小管中加入20ul酶切体系：质粒 8ulECOR1 1ulH2O 8ulKPN1 1ul10X Buffer 2ul轻轻混匀，置于37度水浴1h,终止反应电泳：酶切产物电泳，直接取5ul加入点样孔（是否加入loading buffer与反应加入试剂有关）；质粒电泳需要加入loading buffer混匀后加入点样孔。

3电泳检测质粒提取结果琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但不要认为你看到的 是超螺旋、线性和开环这三条带碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA, 用 EcoRI来线 性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样 其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完 全的两个质粒连在了一起）如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这 条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7 — 10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的 超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致电泳处理结果如下：结果分析:电泳图中左数5〜8条带为二组实验结果，其中5, 7条带为酶切电泳，6, 8条带为质粒 电泳结果酶切结果，将质粒分为1000bp左右的单链DNA和2000bp左右的开链环质粒， 所以开链环状质粒电泳速度＜单链DNA；而质粒电泳结果显示清晰的一条带，说明质粒提取 结果不错。