API2靶向抑制PI3K-Akt信号通路干预胃癌细胞生长的研究.docx

API 2靶向抑制PI3K/Akt信号通路干预胃癌细胞生长的研究【摘要】目的研究蛋白激酶B抑制剂 2 (API 2) 靶向抑制PI3K/Akt信号通路中Akt位点，从而对胃癌细胞生长的影 响方法 使用API 2处理人胃癌细胞株SGC7901o IVTT法检测 0,2, 4, 6, 8 p nl/L API 2作用不同时间对细胞增殖的影响;荧光 染料ACY EB染色观察不同浓度API 2作用24 h后细胞凋亡情况； 流式细胞仪检测细胞周期变化；Astern bl ot法检测p AKT蛋白 以及下游蛋白M k B表达情况结果API 2可抑制SGC7901细 胞的增殖，并呈浓度和时间依赖性；不同浓度API 2作用24 h后， 对细胞的部分周期有明显的影响，也可直接导致肿瘤细胞凋亡、坏死， 并且p AKT蛋白及下游蛋白M k B表达均减少结论API 2 有效地抑制PI3K/Akt信号通路中Akt位点,影响SGC7901细胞的周 期，减少hF K B的表达，具有增殖抑制及诱导凋亡作用关键词】胃肿瘤;蛋白酶抑制药;1磷脂酰肌醇3 激酶;蛋白 质丝氨酸苏氨酸激酶;M K B;信号传导;细胞凋亡;肿瘤细胞，培养 的ABSTRACT: Cbj ecti ve To study the effect of the i nhi bi ti on of Akt by API 2 i n PI3K/Akt si gnal i ng pathvvay on the grovlhof gastri c cancer cel I s・ l\^t hods SGC7901 cel I s v\ere treated w th API 2. The effect of API 2 (0 , 2,4,6 , 8 p ikdI /L) on thei r prol i ferati on\Aas observed w th MT assa y. Cel I apopt os i s after treated w th API 2 for 24 h v\as observed by ACYEBdoubl e stai ni ng for fl uorescence nncroscopy. Cel I eye I e v\as anal yzed by fl ow cytorietry ( FCM ・ The expressi on of p AKT and hFApo pt os ik B v\as detected by Vastern bl ot. Resul ts API 2 (0 , 2 z 4 , 6,8 p nrol / L) si gni f i cant I y i nhi bi ted the prol i ferati on of SGC7901 cel I s i n dose and ti rre dependent nanner. Wien treated w th di ff er ent densi ti es of API 2 for 24 h, parts of t he cel I eye I e of SGC7901 cel I s \Aere obvi ousl y bl ocked.s and necrosi s of the tunr cel I s v\ere i ncreased v\hi I ep AKT and hF k B expressi on v\as decreased. Concl usi on API2 can i nhi bi t prol i ferati on and i nduce apopt os i s of SGC7901 cel I s by eff ecti vel y in hi bi t i ng Akt i n PI3K/Akt si gnal i ng pathv\ay, affect in g cel I cycl e di stri but i ons of the cel I s, and great I y reduci ng the expressi on of hF k B.i nhi bi tors; 1seri netransducti on;KEY V€RDS: storrach neopl as ns; proteasephos phat i dy lin osi tol 3 ki nase; protei n threoni ne ki nases; hF kappa B; si gnal apopt osi s; turra)r cells, cul turedPI3K/Akt信号通路作为细胞内重要信号转导通路之一，在细胞内 发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用，与人类多种肿瘤的发生发展 密切相关。

核因子 k B （ nucl ear factor kappa B , l\F k B） 为该信号通路下游的一个效应分子，调节细胞基因转录的关键因子, 参与多种相关基因的转录调控，其活性的失控与部分肿瘤密切相关， 在肿瘤的发展过程中起重要作用［1 2］o蛋白激酶B抑制剂 2（Akt/protei n ki nase B si gnal i ng i nhi bi tor 2, API 2）是 目前明确的Akt通路小分子抑制剂，能有效地选择性抑制肿瘤细胞中 过度表达的Akt，从而抑制细胞生长及促进细胞调亡［3］本研究使 用API 2抑制PI3K/Akt信号通路中Akt位点，了解Akt与l\F K B在胃癌细胞中表达的关系，及对胃癌细胞生长的影响，旨在寻找胃 癌治疗的新靶点1材料与方法1.1材料人胃癌细胞株SGC7901 （上海细胞生物研究所），胎牛血清（杭 季青公司），RPM 1640（美国QBC0公司），API 2 （德国l^rck Cal bi ochem公司)，四甲基偶氮U坐蓝［3 (4、5di rrethyl thi azol 2YL ) 2 ,5 di phenyl tetr azol i umbrormde , MT］与二甲基亚硕I ( di rrethyl sul f oxi de , EMO)(美国 Arnesco 公 司),兔抗人p AKI1/2/3 ( Ser473 )多克隆抗体、鼠抗人hF k B（p65）单克隆抗体（美国Santa Cruz公司），V^stern bl ot试剂盒（美国KPL公司）,PDH抗体（上海碧云天公司X1.2方法1.2.1细胞培养SGC7901细胞接种含10%胎牛血清的RPM 1640培养基中， 置37弋、体积分数为0. 05的CC2培养箱中培养，按常规胰酶消化 传代，取对数生长期细胞用于实验。

使用不同浓度API 2处理人胃 癌细胞株SGC7901 ,以未使用API 2处理的SGC7901细胞为对照1.2.2增殖抑制实验SGC7901细胞以每孔5x 103接种于96孔培养板中API 2 用DIVEO溶解，并调整顾0终浓度为0. 06%o用0,2, 4, 6, 8 p nl/L API 2分别处理细胞24, 48, 72, 96 h后，加入IVTT作用5入 离心， 弃上清液，加入DIVEO振荡溶解后，用酶联免疫检测仪于490 nm波长 读取吸光度值，计算增殖抑制率以上实验重复3次增殖抑制率珂（对照组吸光度值 实验组吸光度值）/对照组吸光 度值］X 100%1.2.3 口丫H定橙/j臭化乙锭双荧光染色（ACYEB）测定细胞凋亡细胞以每孔5x 105接种在6孔培养板中，用0,4 p rrol/LAPI 2分别作用24 h ,胰酶消化，离心收集细胞，PBS悬浮细胞2次， 取100 p L PBS稀释的细胞悬液，加2 p L的AOEB染色液，各含 100 p g/nt , 30 s后观察照相随机计取5个视野共100个细胞中 凋亡细胞百分数实验重复3次凋亡率二总凋亡细胞数/细胞总数X 100%1.2.4流式细胞仪分析细胞周期的影响对数生长期细胞用0,2,4 6,8 p rrol/LAPI 2分别作用24h, 用胰酶消化后，收集2x 106细胞,预冷PBS洗涤1次,加入70%乙 醇4 OC固定过夜。

离心弃乙醇,PBS洗涤2次后加入只2酶（1 ng/ntL） 240 p L ,37弋水浴30 ran后，加入PI综合染液（PI浓度为124 p g/ntL ,TritonX 100浓度为 0.124% ） 1 nt ,4 C避光染色 30 ran f 流式细胞仪进行检测实验重复3次1.2. 5 Vaster nblot 检测 p AKT( Ser473 )及 l\F k B( p65)蛋白表达收集0,4,8 p nrol/LAPI 2分别作用24 h的细胞各2x 106, 加入RIPA裂解液，4弋离心,12 000 r/mn , 10 mn ,提取上清并 用酶联免疫检测仪测定蛋白浓度SC6 PAGE电泳分离蛋白(每泳道50 pg)后，电转移至2膜，封闭后分别加入一抗p AKT(1 : 500)或 l\F K B( 1 : 200),4 C过夜，孵育 2h ,TBS T20( 0. 05%) 漂洗后二抗(FRP标记的 Goat anti l\S IgG或 G)at anti Rabbi tIgG)孵育2 h ,漂洗后用ECL化学发光试剂盒进行检测实验重复3 次结果进行灰度扫描后，Quantity Che分析软件测定平均光密度， 并以G^PDH为内对照，计算p AKT ( Ser473\ KB(p65)的相对表达量。

1.3统计学处理数据均采用中位数士四分位间距［M：(送)］表示用SPSS 13. 0 统计软件包进行统计分析，对照组与各实验组之间分别行Snn \Ahi t ney U检验,两变量间相关性采用Spear ran相关分析2结果2.1 API 2对SGC7901细胞增殖的影响2-8 p m）l/L API 2可以抑制SGC7901细胞增殖,并呈明显浓度和时间依赖性（图1I22. 2 API 2对SGZ7901细胞凋亡的影响不同浓度API 2作用24 h后，荧光显微镜下观察实验组中 可见较多凋亡及坏死细胞，而对照组中大部分为活细胞，其胞膜完整, 染色质分布均匀，呈均匀弥散绿色荧光（图2、凋亡率实验组为 13.2% ,对照组为6. 8%o2.3 API 2对SGC7901细胞周期的影响不同浓度API 2作用24 h后，与对照组相比，在G1期，2,4 p nl/L组与对照组的差别均有统计学意义（P< 0. 05 ）;在G2期， 各实验组与对照组的差别均有统计学意义（P < 0. 05 ）,在S期，各实 验组与对照组的差别均无统计学意义（P>0. 05）（表11表1不同 浓度API 2作用24 h对SGC7901细胞周期的影响（略）2.4 API2对SGC7901细胞pAKR Ser473 \ ITK 区 p65)蛋白表达的影响与对照组相比较,4、8 p nl/LAPI 2可使p AKRSer473>hf k B(p65)蛋白表达水平下降，并呈浓度依赖性，不同浓度实验组之间有差别，相关分析表明p AKT ( Ser473 )表达与l\F k B(p65)表达呈显著正相关(r=0. 939 , P=0. 000 )(表2 ,图3》表2不同浓度API 2作用24 h对S&7901细胞AKT和l\F K B表达量的影响(略)3讨论在我国,胃癌是发病最咼的癌症之一,对于胃癌的治疗方案主要 仍为传统的手术、化疗，且治疗效果和预后不容乐观。

国内外学者一 直致力于寻找胃癌治疗的新方向PI3K/Akt信号通路作为细。