特异性抗体的制备.ppt

第十四章 特异性抗体的制备技术 Preparation of Specific Antibody第一节 免疫原的制备 第二节 免疫血清的制备 第三节 单克隆抗体的制备 第四节 基因工程抗体技术 小结 第一节 免疫原的制备• 一、颗粒(细胞)性抗原制备 • 二、可溶性免疫原制备 • 三、人工抗原的制备 • 四、佐剂 绵羊红细胞的制备流程图摇动 15-20min 4℃可保存3周取适量 NS洗涤3次 2000r/min 10minNS稀释至 2～5% 细菌细胞抗原的制备流程图液体培养或 斜面培养 37℃24h100℃水浴 2～2.5h 杀菌无菌试验NS稀释成8～10亿/mlO菌体抗原返回 •可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、 补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸 •来源: 主要是组织和细胞，其成分也比较复杂 (一).组织和细胞可溶性抗原的制备 (二).蛋白质的提纯 (三).免疫球蛋白片段的制备 (四).纯化抗原的鉴定 返回 上清液 澄清所用材料必须是新鲜或低温保存的去除包 膜或结 缔组织脏器进行灌洗洗去血迹 及污物 NS内含0.5g／L NaN2冷浴中组织剪碎装入捣碎机简内高速 粉碎制成组织匀浆液3000r／min×10min取上清液去除细胞碎片 及微小组织离心组织和细胞成分混合抗原制备程序1.酶处理法 2.冻融法 3.超声破碎法 4.表面活性剂处理• 常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等 • 方法：在一定的条件下，能消化细菌和 • 组织细胞 • 特点：①此法适用多种微生物； • ②具有作用条件温和； • ③内含物成分不易受到破坏； • ④细胞壁损坏的程度可以控制。

2.超声破碎法• 原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎 • 由于超声波发生的空化作用（cavitation）使得液 • 体形成局部减压引起液体内部发生流动，漩涡生成 • 与消失时，产生很大的压力，使细胞破碎超声波 • 所使用的频率从1kHz～20kHz不等，间歇进行，避 免长期超声产热，导致抗原破坏 • 特点：①操作简单，重复性较好，节省时间； • ②多用于微生物和组织细胞的破碎4.表面活性剂处理 •原理：在适当的温度、pH及低离子强度的条 件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡， 使膜的渗透性改变或使之溶解 •常用的有：十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、 二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯 （非离子型）、新洁尔灭等 •应用：①破碎细菌，且作用比较温和； ②提取核酸时，常用此法破碎细胞返回 •蛋白质是良好的抗原，要制备特异性高的 抗血清通常需要纯化可采用如下方法： 1.超速离心法 2.选择性沉淀法 3.凝胶层析法 4.离子交换层析法 5.亲合层析法• 原理:利用各颗粒在梯度液中沉降速度不 同，使具有不同沉降速度的颗粒,处于不同 密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。

• 特点：用超速离心或梯度密度离心法纯化抗 原，极难将某一抗原成分分离出来 • 应用：用于少部分大分子抗原和一些比较轻 的抗原物质的分离，如IgM、C1q、甲状腺球 蛋白、载脂蛋白A、B等•原理：根据各蛋白质理化特性的差异，采用 各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原 成分沉淀，从而达到纯化的目的 •常用方法：盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解 度不同）；常用33～50％饱和度的硫酸胺 •特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白 •应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化• 原理：凝胶是具有三维空间多孔网状结构的物质， 经适当的溶液平衡后，装入层析柱当含有各种分 子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝胶网孔结构内，反复受 到阻滞，洗脱较慢分成大、中、小三种类型 • 特点：简单易行，但掌握不好，分离效果较差 • 原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位 置，从而使血清中的蛋白质分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。

5．亲和层析法（亲和色谱）•原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术将纯化的抗IgG附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析柱当样品流过此柱时，待分离的IgG可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体(抗 IgG)结合；当改变洗脱条件可重新解离，从而将待分离的免疫球蛋白洗脱下来，达到纯化的目的 •优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性正常细胞 ＋标记细胞 洗滴标记细胞 被酶裂解加入特异 性抗体其它蛋白 洗涤流失SDS-PAGE 分离蛋白返回 亲和层析法示意图 •大分子的核酸具有免疫原性提取核酸的主要步骤： 破碎细胞核酸从细胞中游离出来酸沉淀核除去蛋白质乙醇酚和氯仿类脂多糖抗原制备 •苯酚法提取LPS： 干燥菌体 或湿菌体水中 混匀激烈搅匀 加热5min冰水 急冷降至10℃以下离心上层的水层(含LPS) 下层的酚层 菌体残渣于底部吸取 水层透析 除酚加热超速离心浓缩LPS 在上层 沉淀的透明 胶状部内绞出悬于水中离心 得纯化LPS同温的苯酚1．酶裂解法 酶对免疫球蛋白的水解有极好 的专一性，不同的酶可将免疫球蛋白裂解 为不同的片段。

2．氧化法和还原法 是将免疫球蛋白轻、重 链分开的两种常用方法 3. 还可用强变性剂或利用改变pH将免疫球蛋 白亚单位分开酶水解免疫球蛋白示意图 Fc段，用以制备抗重链血清F(ab’)2，常作为抗体试剂用于试验木瓜蛋白酶 （papain)胰蛋白酶 (pepsin)胃蛋白酶 (pepsin)返回 • 1.氧化法：优点是切开后，肽链不能重新形 • 成二硫键、便于肽链纯化；缺点是色氨酸 • 侧链容易被破坏 • 2.还原法：将二硫键还原成巯基但极不稳 • 定，易重新形成二硫键，必须及时用碘乙 • 酸或碘化酰胺进行羧甲基化 氧化法和还原法评价 纯化抗原的鉴定 (四) 纯化抗原的鉴定 1.含量鉴定 2.分子量鉴定①凝胶层析技术进行测定 ②聚丙烯酰胺凝胶电泳 ③凝胶管状电泳 ④超速离心 3.纯度鉴定：免疫电泳，醋酸纤维膜电泳 4.免疫活性鉴定：常用双向琼脂扩散试验三、人工抗原的制备• 人工抗原：是指经过人工修饰后具有免疫 原性的半抗原如：低分子量的化学物质 例如多糖、多肽、甾族激素、脂肪胺、 类脂质、核苷、某些药物(包括抗生素）及 其他化学物品等 • (一)载体的选择 • 1.蛋白质：人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔 • 血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。

• 2.多肽聚合物：人工合成的，常见的有多聚赖 • 氨酸，其分子量大（可达十几万到几十万)，这 种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动物产生 高效价、高亲和力的抗体 • 3.大聚合物：羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮 • 等，可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂亦 • 可诱发动物产生抗体碳化二亚胺法：R-NH=CH-R’ 半抗原＋载体蛋白质 搅拌1～2h 室温24h透吸除去未反 应的半抗原人工免疫原混合(二) 半抗原与载体的连接混合戊二醛法:半抗原-NH2 载体蛋白-NH2半抗原-N=CH-(CH2)3-CH=NH-载体蛋白OHC-(CH2)3-CHO*戊二醛是常用的带有两个活性基团的双 功能联接剂氯甲酸异丁脂法： 半抗原-COOH 载体蛋白-NH2Cl-COO-CH2CH(CH3)2半抗原-COO-COO-CH2CH(CH3)2 半抗原-CO-NH-载体蛋白 简便，用于类固醇抗原制备HO-CH2CH(CH3)2＋琥珀酸酐法：用于不含羧基衍生物半抗原制备 半抗原-CH2OHCH2-CO CH2-CO 带羧基的半抗原琥珀酸衍生物 半抗原-CH2-OOC-CH2-CH2-COOH 返回 吡啶再经氯甲酸异丁脂法或碳化 二亚胺法制备载体半抗原(三) 人工抗原的鉴定• 至少20个以上的半抗原分子连接到一个载 体分子上，才能有效地产生抗体。

四、佐剂* 概念：与抗原同时或预先注射于机体，能增 加机体免疫应答或改变免疫应答类型的物质 条件：①增加抗原的表面积； ②改变抗原的活性基团构型； ③佐剂与抗原混合能延长抗原在局部 组织的存留时间； ④可直接或间接激活免疫活性细胞； ⑤无毒性或无副作用1.氢氧化铝佐剂： 5%硫酸铝5%氢氧化钠氢氧化 铝沉淀制成悬液 即为佐剂强烈搅拌NS洗 二次 NS等体积抗原免疫接种10%硫酸钾铝氢氧化钠校正pH值至6.5沉淀乳状悬液* 明矾佐剂抗原常用用于肌肉注射，皮下注射 易引起肉芽种和脓肿NS搅拌NS洗 二次离心抗原备用防腐剂•作用大于不完全佐剂 •局部形成肉芽种和溃疡 •不能用于人体 弗氏完全佐剂3.弗氏佐剂(Freund adjuvant)液体石蜡完全乳化备用＋高压 灭菌加热抗原弗氏不完全佐剂卡介苗羊毛脂鉴定 一滴 乳剂乳剂不散 浮于液面水中混合•目的:①增强抗原对机体的免疫原性； ②增强抗体的产生能力； ③为制备出高效价的免疫血清； ④增强可溶性抗原的免疫原性； ⑤在某种情况下，要改变抗原免疫应答类型； ⑥延长抗原在免疫动物的时间； ⑦改变抗原的分布； ⑧增强局部对变应原的超敏反情况；①佐剂常混有微量其它物质，这些物质进 入体内后也可引起抗体的产主，影响抗 血清的特异性； ②注射佐剂可引起局部形成肉芽肿和无菌 性脓肿； ③反复注射，易发生超敏反应，使局部组 织坏死，甚至引起动物死亡。

返回 一.选择免疫动物 二.免疫方法 三.动物采血法 四.免疫血清的纯化 五.抗血清的鉴定与保存 第二节 免疫血清的制备•能作为免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类 兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马 (一).抗原与动物种属关系：差异越远越好； (二).动物的个体状况：适龄、健壮、正常、 体重合乎要求； (三).抗原的性质：不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫应答； (四).按免疫血清用量和要求：选择不同物一).免疫原的注射剂量 (二).免疫间隔时间：首次与二次尤为重要，整免疫过程5至8次 (三).免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉＞腹腔＞肌肉＞皮下＞皮内＞淋巴结＞足掌 1.颈动脉放血法：羊、兔最常用的方法 2.静脉采血法：羊、兔，小鼠断尾或眼球 3.心脏采血法：操作熟练如兔、豚鼠、鸡四、免疫血清的纯化 • (一) 特异性抗体的纯化 • 1.亲合层析法：将交叉抗原交联到Sepharose • 4B上，装柱，将预吸收抗体通过亲合层析柱， 杂抗体吸在柱上，流出液是特异性抗体 • 2.吸附法：利用不含特异性抗原的抗原液，直 • 接加到免疫血清中，抗原则与抗体结合，上 • 清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。

二) IgG类抗体的纯化• 1.盐吸沉淀法：经硫酸铵盐吸提取γ球蛋白 • 3次，基本为IgG类抗体，但不纯 • 2.离子交换层析法：DEAE纤维素或QAE纤 维素 • 3.亲和层析法：将抗原交联Sepharose 4B 制成亲和层析柱(抗血清、过柱、洗脱、改 变洗脱液酸硷度、IgG从层析柱解离、收集 )• (一).抗体效价的鉴定：即为抗体活性滴定 • (二).抗体特异性鉴定： • ①细菌类抗原的抗体用凝集试验 • ②可溶性抗原的抗体用双向琼脂扩散试验 • (三).抗体的纯度鉴定：免疫电泳分析法 • (四).抗体亲和力鉴定：亲和力高则灵敏度好 • 五、抗血清的鉴定与保存• (五) 抗血清的保存 •。