在体外实验中白术内酯I修复HO.docx

在体外实验中白术内酯 I 修复 HO-1 表达和抑制 ox-LDL 诱导的 VSMCs 增殖， 迁移和炎症反应动脉粥样硬化的发病机理是以血管平滑肌细胞（VSMCs ）的增殖和迁移以及炎 症斑块为特征这篇文章的目的是，阐明白术内酯I通过氧化修复低密度脂蛋 白（ox-LDL ）诱导血管平滑肌细胞炎症作用，增殖和迁移的作用这里，我们 发现白术内酯I以剂量依赖的方式抑制oxLDL诱导的VSMCs增殖和迁移，并 且在VSMCs中减少炎性细胞因子的产生和单核趋化蛋白1（ MCP-1 ）的表达 这项研究也显示出AO-I显著的抑制p38-MAPK和NF-kB活性更重要的是， 在oxLDL诱导的VSMCs中，特异性的亚铁血红素氧化酶1（ HO-1）抑制剂 锌原卟啉（ZnPP）IX部分的消除白术内酯I的有益作用此外，白术内酯I在 oxLDL诱导的巨噬细胞中阻断泡沫细胞的形成总之，在VSMCs增殖和迁移 中AO-I的抑制作用，脂质过氧化反应和随后的炎症反应可能有助于AO-I的抗 动脉粥样硬化的特性动脉粥样硬化是一个伴随血管损伤过程的炎症性病变，通过以往的研究进 行了探索和研究［1,2］有一些证据表明炎症是动脉粥样硬化疾病发生和发展的 关键因素之一。

在动脉粥样硬化早期，各种刺激因子诱导动脉壁脂质堆积，导 致炎症介质释放、细胞粘附、脂质斑块生成、平滑肌增生和迁移［3］氧化修饰 低密度脂蛋白（ox-LDL ）通过促进纤维物质的分泌，促进血管平滑肌细胞增殖 和迁移，增强炎症反应，增强纤维斑块［4 ］ox-LDL诱导的VSMC增殖和迁 移的抑制是动脉粥样硬化治疗的潜在的治疗靶点［5,6］此外，巨噬细胞与动脉 粥样硬化病变的血管炎症反应有关［ 7 ］针对动脉粥样硬化的复杂性，有必要 探讨动脉粥样硬化形成的机制，寻找治疗动脉粥样硬化的新的药用成分在动脉粥样硬化的病理过程，肿瘤坏死因子-a （ TNF-a ） ［ 8 ］，白细胞介 素（ IL-6） ［ 9 ］和一氧化氮（ NO） ［10］，介导一系列急性炎症反应［11］大量 NO的产生可导致iNOS的过度表达，导致低密度脂蛋白的氧化［12 ］这些炎 症因子在动脉损伤过程中的上调，间接促进血管平滑肌细胞的迁移和增殖，加 速动脉粥样硬化的病理变化以前的研究也表明这些因素通过激活丝裂原活化 蛋白激酶（MAPK ）和核因子k B（NF-k B ）信号转导通路的［13-15］促使动脉 粥样硬化形成单核细胞趋化蛋白-1（ MCP-1）对单核细胞高亲和力和可以在巨噬细胞、 内皮细胞和血管肌细胞中表达，这些细胞由多种炎症因子引起的，如白细胞介 素、肿瘤坏死因子a、干扰素丫。

研究表明，MCP-1促进单核细胞转化为巨噬 细胞和泡沫细胞的形成［ 16 ］同时，活化的血管细胞能释放大量的生长因子， 促进血管平滑肌细胞的增殖和迁移［ 17 ］动脉粥样硬化斑块中核转录因子调节 MCP-1表达的转录［18 ］血红素加氧酶-1 （ HO-1）作为一种原始的和限速酶在血红素降解中生成 胆绿素、一氧化碳和铁，抗氧化、抗炎、细胞凋亡的抑制、改善微循环中发挥 重要的作用［19,20］研究表明，HO-1调节血管平滑肌细胞的迁移、增殖和凋 亡，此外，它维持血管系统的稳定［21,22］此外，在HUVECs中ox-LDL通过 Nrf2/HO-1通路诱导MCP-1的表达［23 ］锌原卟啉（ZnPP）IX作为HO-1 的抑制剂［ 24 ］白术内酯1（ AO-I）（化学结构如图1所示）作为一种从白术中提取的主 要生物活性成分，已被用于治疗炎症性疾病［25,26］AO-I对LPS诱导的急性 肺损伤具有显著的保护作用［27 ］AO-I已被发现能抑制小鼠气囊模型和小鼠 主动脉环和腹腔巨噬细胞共培养模型的血管生成的抑制慢性炎症通过LPS诱 导巨噬细胞中，AO-I也降低TNF-a和NO的产生［29 ］。

此外，AO-I也指出 其他一些生物活性如抗过敏反应［30 ］，在人白血病HL-60细胞的增殖［31,32］ 中细胞毒活性和抗癌活性［33 ］根据此前的报道，我们推测，AO-I可能经过 炎症反应伴随的病理过程治疗动脉粥样硬化为了描述AO-I的抗动脉粥样硬 化的作用，我们测量氧化低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞迁移和增殖，在 RAW 264.7巨噬细胞中减少泡沫细胞的形成和上清液中TNF-a、IL-6、NO， 与 MCP-1 的水平为了进一步研究 AO-I 抗动脉粥样硬化的机制，对 MAPK， NF-kB信号通路和HO-1的表达进行了研究因此，本研究的目的是确定AO- I在抗动脉粥样硬化的潜在作用，并提供一个AO-I的药理作用的分子机制2. 材料和方法2.1. 材料和试剂白术内酯I（ AO-I）是由Da'lian melonepharma有限公司提供（大连， 中国）高氧化低密度脂蛋白（90 nmol MDA/ mg蛋白）购自Yiyuan Biotechnologies （广州，中国）乙二胺四乙酸（EDTA）和二甲基亚砜 （DMSO ）从Sigma （ sigma化学公司，圣路易斯，穆村，美国）获得。

锌原 卟啉 IX、SB203580、SP600125 , U0126 和 Bcap37 购自 Sigma （圣路易斯， 穆村，美国）DMEM和RPMI-1640自购自Gibco （ GIBCO-BRL，盖瑟斯 堡,MD,美国）大鼠TNF, IL-6和MCP-1的酶联免疫吸附试验（ELISA ） 试剂盒是从R&D系统（明尼阿波利斯,MN ,美国）购买的多克隆抗体抗 pP38、p38、pJNK, pJNK, ERK1 / 2 , ERK1 / 2 和 NF-k B p65 从 R&D 系 统采购（明尼阿波利斯、MN、美国）多克隆抗体抗HO-1和PCNA购自 Stressgen （安娜堡，米河） 抗3磷酸甘油醛磷酸脱氢酶（ GAPDH ）抗体从 生物圣克鲁斯公司购买（圣克鲁斯,CA,美国）聚偏氟二烯（PVDF ）膜从 Pall Gelman实验室购买（安娜堡、米河、美国购买）其他试剂均为市售分 析级2.2. 细胞培养和治疗从胸主动脉中平滑肌细胞进行培养雄性SD大鼠（100-120 g ）与水合 氯醛麻醉胸主动脉进行分离，同时去除粘合剂脂肪和问题简而言之，对血 管内膜的内皮细胞层被去除主动脉动脉切成约1毫米的片段，并放置在一个 37°C DMEM高糖培养基含有10%热灭活胎牛血清的细胞培养容器（FBS ）, 然后移转移到95%的空气和5%的CO2的箱中。

当细胞达到90%汇合时就可 以进行实验了细胞（通道 3-8）通过免疫组化染色平滑肌肌动蛋白对他们的 “hilland-valley "外观鉴定（博士德、武汉、中国）7天腹腔注射1%巯基乙酸钠后，从雌性昆明种小鼠（20-25g ）腹腔的分 泌细胞中分离巨噬细胞第七天将小鼠使用CO2处死后，用5毫升磷酸盐缓冲 生理盐水灌洗液，离心5分钟收集的细胞用磷酸盐缓冲盐水洗三次，然后悬 浮培养于含10%胎牛血清的培养基中在37C培养箱中，空气95%，二氧化 碳5%AO-I, ox-LDL中培养和在二甲基亚砜（DMSO ）中溶解和在DMEM 培养液进一步稀释DMSO终浓度小于0.5%2.3. TNF-a , IL-6 和 NO 的测定收集细胞上清液评价在VSMCs的培养中，AO-I对于TNF-a , IL-6和NO 产生的作用VSMCs分别接种到24孔培养板的密度为1x104细胞/孔，在含 10%胎牛血清的DMEM培养基中37C孵育24 h细胞达到80%汇合后，在 无血清培养基中孵育24小时然后细胞预先用不同浓度的AO-I处理24小时 后，细胞用ox-LDL刺激24 h , 4C离心10分钟得到的上清液，它们被存储在 -80C,用于TNF-a、IL-6和NO的定量。

TNF-a和IL-6的测定分别采用市 售的ELISA试剂盒，根据制造商的说明进行用Griess反应定量分析NO酶 联免疫吸附法测定ox-LDL诱导的TNF-a和IL-6的动力学所有细节的处理 均在图例中表示2.4. MCP-1 的测定在 VSMCs 中，收集细胞上清中估计 AO-I 对于 MCP-1 的影响（作为一个 重要的趋化因子）将细胞接种到24孔培养板的密度为1x104细胞/孔，24 h 在37C下孵育然后预处理细胞与不同浓度的AO-I处理24 h或无抑制剂（SB203580作为p38抑制剂、JNK抑制剂为SP600125，如ERK抑制剂为 U0126，BAY11-7082作为NF-kB抑制剂），接着与ox-LDL诱导刺激24 h , 然后4工通过离心分离10分钟MCP-1测定使用市售的ELISA试剂盒，根据 制造商的指示所有的细节处理均在图例中表示2.5. VSMCs 增殖实验用MTT法测定细胞活性和ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞增殖情况，如前 所述［34 ］简而言之，血清饥饿VSMCs通过AO-I的指定浓度预处理1 h , 然后用ox-LDL处理24h在MTT添加过后，紫色甲瓒晶体溶解在DMSO中 并且用 540nm 吸光度测定。

按对照组的百分比计算细胞活性和增殖率（未处 理 VSMCs）2.6. VSMCs迁移实验ox-LDL介导的VSMC迁移是通过2种方法确定：划痕法和Boyden小室 法检测［35 ］对于伤口愈合实验，VSMCs被播种在12孔板（每孔1x105细 胞）和生长汇合将饥饿的单层细胞安装在可重复使用的模板上，形成标准的 无菌切口，然后用温PBS冲洗然后将细胞与AO-I（ 12.5 , 25或50》m ）孵 育1小时，通过有无ox-LDL （ 100》g/ml）刺激24小时创面愈合率通过荧 光显微镜直接观察（徕卡DM IRB ；韦茨拉尔、德国）该程序允许在0小时， 12 h 和 24 h 拍摄的相同点迁移距离用 Scion Image 软件分析改良的Boyden小室法，通过24孔Boyden小室含纤连蛋白涂层的聚碳 酸酯膜的评估（8》m孑L径、BD生物科学，美国）简而言之，就是细胞在含 0.1%牛血清白蛋白的无血清培养基中，以密度为2000接种在室的上孔，然后 迁移到含有或无100》g/mL ox-LDL的无血清培养基中，随着AO-I如图表明 迁移 5 小时后，当细胞粘附下表面时，非迁移的细胞附着膜的上表面，放在 载玻片上固定于10%福尔马林中并用Hoechst33342染色。

通过在显微镜下 计算五个随机选择的区域，测定每孔细胞迁移通过膜的数量（ x200）2.7. 免疫印迹分析在 ox-LDL 诱导的 VSMCs 中 HO-1 , PCNA , MAPKs 和 NF-kB p65 蛋白 的表达激活，用Western blot检测按照以前的研究［36 ］收集细胞裂解液和 蛋白浓度通过BCA蛋白实验测定（Applygen科技有限公司，北京，中国） 用10% SDS-PAGE分离蛋白（50 p g），转移到硝酸纤维素膜上在TTBS中 室温下膜封闭用5%脱脂奶粉2小时，4C-抗体过夜如下：HO-1、PCNA （在TBST中1:500稀释），总p38，磷酸化38，总细胞外信号调节蛋白激酶 （ERK1 / 2）,磷酸化ERK1 / 2，总应力活化蛋白激酶c-jun-氨基末端激酶 （JNK）,磷酸化JNK和 NF-kB p65 （在TBST1:200稀释）和 GAPDH （在 TBST1:500稀释）用TBST扩大洗膜后，用1:5000稀释辣根过氧化物酶标 记的二抗孵育（NEB , MA ,美国）蛋白质检测是用化学发光系统和用 GraphPad Prism 5.01 量化（加利福尼亚，美国）。

2.8. 泡沫细胞和油红O染色巨噬细胞接种到6孔板中，每孔1x105细胞细胞在含10%胎牛血清的 RPMI164。