二甲双胍对肺腺癌生长的抑制作用及其机制研究.doc

内科学内科学 呼吸系病专业毕业论文呼吸系病专业毕业论文 [ [精品论文精品论文] ] 二甲双胍对肺腺癌生二甲双胍对肺腺癌生长的抑制作用及其机制研究长的抑制作用及其机制研究关键词：二甲双胍关键词：二甲双胍 肺腺癌肺腺癌 细胞周期细胞周期 细胞凋亡细胞凋亡 抑制作用抑制作用摘要：第一部分二甲双胍对肺腺癌细胞体外增殖的作用研究 目的：研究二甲 双胍对体外培养的肺腺癌细胞株的增殖、细胞周期、凋亡等方面的作用，观察 二甲双胍与顺铂联合使用对细胞生长的影响 方法：以 0、0.5、2、8mmol/L 四种浓度的二甲双胍分别对肺腺癌细胞株 A549 和 NCI- H1299 进行体外干预，在第 0、24、48 和 72h，以 MTT 法检测各组细胞的增殖情 况将上述各浓度的二甲双胍与顺铂(10ug/mL)联用后，再次检测药物干预不同 时间后细胞的活性变化选取 A549 细胞株为主要研究对象，以二甲双胍干预 48h 后，采用流式细胞术检测各组细胞在细胞周期及早期凋亡率等方面的差异结果：(1)与对照组相比，二甲双胍 2mmol/L 组和 8mmol/L 组细胞的增殖活 性在药物作用 24h 后即明显下降，以后者的下降更为明显；0.5mmol/L 组细胞 在药物作用 48h 后也呈显著的生长抑制。

随着干预时间延长，二甲双胍对各组 细胞增殖的抑制更加显著2)二甲双胍与顺铂联合使用时，对肺腺癌细胞增殖 的抑制作用较单用顺铂更强；二甲双胍的浓度越高、对细胞干预的时间越长， 该抑制作用越明显3)二甲双胍干预 A549 细胞 48h 后，与对照组相比， 0.5mmol/L 组细胞的周期分布及早期凋亡率均无明显变化；2mmol/L 组 G1 期细 胞所占比重显著增高(P＜0.05)，而 S 期细胞比重显著降低(P＜0.01)，细胞的 早期凋亡率显著增加(P＜0.05)：8mmol/L 组 G1 期细胞所占比重显著升高，S 期 和 G2/M 期细胞则相应减少，细胞的早期凋亡率也明显增高(均 P＜0.01) 结论：二甲双胍可以使细胞周期循环阻滞于 G1 期，并诱导细胞的早期凋亡增加， 从而有效抑制肺腺癌细胞株的体外增殖，其作用呈浓度及时间依赖性增强；二 甲双胍与顺铂共同作用可以增强对肺腺癌细胞生长的抑制作用 第二部分 JNK/p38 MAPK-Caspase 信号传导通路在二甲双胍诱导肺腺癌细胞凋亡中的作用 研究 目的：研究二甲双胍对 A549 细胞内 AMPK、JNK、p38 MAPK 的磷酸化蛋 白及 Caspase 家族蛋白表达水平的影响，探讨 JNK/p38 MAPK-Caspase 信号传导 通路在二甲双胍诱导的肺腺癌细胞凋亡中的作用。

方法：以 5mmol/L 的二甲 双胍对 A549 细胞进行体外干预，在干预的第 0、15、30 和 60min 时，分别抽提 细胞总蛋白，以 Westernblot 技术检测细胞内 AMPK、JNK、p38 MAPK 的总蛋白 和磷酸化蛋白的表达：在干预后第 0、12、24 和 48h，检测剪切后的 Caspase- 3、8、9 活性蛋白的表达水平选择特异性的 JNK 通路阻断剂 SP600125 和 p38 MAPK 通路阻断剂 SB202190 分别对细胞进行预处理 1～2h，再进行二甲双胍 (5mmol/L)干预，48h 后，采用流式细胞术检测细胞早期凋亡的情况 结果： (1)二甲双胍干预前后，A549 细胞内 AMPK、JNK 和 p38 MAPK 的总蛋白表达强度 无显著变化二甲双胍干预前，细胞内上述蛋白的磷酸化蛋白及剪切后的 Caspase-3、8、9 的表达量极低；p-AMPK、p-p38 和 p-JNK 的表达水平在药物干 预 15min 后即明显增强，至 60min 后明显衰减，而相应的总蛋白则变化不明显； Caspase-8、9 活性蛋白的表达水平在药物干预 12h 后明显增强，24h 后， Caspase-3 的表达也出现增强。

2)流式细胞术检测结果提示，SP600125 和 SB202190 本身对 A549 细胞的凋亡无显著影响；但使用这两种抑制剂分别对细胞进行预处理后，再行二甲双胍干预，细胞的早期凋亡率较单纯二甲双胍干预 组显著降低(P＜0.05) 结论：JNK/p38 MAPK-Caspase 信号传导通路参与了 对二甲双胍诱导的肺腺癌细胞凋亡的调控 第三部分 GADD153 在二甲双胍 诱导肺腺癌细胞凋亡中的作用研究 目的：研究二甲双胍对肺腺癌 A549 细胞 内 GADD153 基因表达的影响，探讨 GADD153 基因在二甲双胍诱导的肺腺癌细胞 凋亡中的作用 方法：以 5mmol/L 的二甲双胍对 A549 细胞进行体外干预， 在第 0、12、24、48 和 72h，抽提细胞总 RNA，采用 Realtime-PCR 技术检测各 时间点 A549 细胞内 GADD153 mRNA 的相对表达量设计并合成 GADD153 靶向 siRNA，将其转染入 A549 细胞，通过 RNA 干扰特异性的抑制细胞内 GADD153 基 因及蛋白的表达采用 Realtime-PCR 和 Western blot 技术验证对目的基因的 干扰效率。

以 5mmol/L 的二甲双胍干预 GADD153 基因干扰后的 A549 细胞，采用 流式细胞术检测药物干预 48h 后细胞的早期凋亡率 结果：(1)二甲双胍作 用 12h 后，A549 细胞内的 GADD153 mRNA 表达水平即显著增高(P＜0.01)；随药 物干预时间的延长，该基因的表达增高更加明显，至 72h 升至最高，约为干预 前的 14.12 倍2)GADD153 siRNA 转染可以有效地抑制 A549 细胞内 GADD153 基因的表达，干扰效率达 86％左右3)流式细胞术检测结果显示，GADD153 基 因干扰对于 A549 细胞的早期凋亡无显著影响；经二甲双胍干预 48h 后， GADD153 干扰的 A549 细胞的早期凋亡率与未干扰的细胞相比明显降低(P＜0.05)结论：GADD153 基因及蛋白的表达增高可促进二甲双胍诱导的肺腺癌细胞的 凋亡 第四部分二甲双胍抑制肺腺癌裸鼠皮下移植瘤生长的实验研究 目 的：通过构建肺腺癌的裸鼠皮下移植瘤模型，研究二甲双胍对于肺腺癌体内生 长的影响及安全性，并探讨二甲双胍在临床抗肿瘤治疗方面的价值 方法： 将人肺腺癌细胞 A549 接种至 BALB/c-nu 小鼠腋背部皮下，建立移植瘤动物模型。

待移植瘤长至约 100mm3 左右时，选取瘤块大小、形状较均一的裸鼠，随机分为 3 组，每组 5 只，以腹腔注射的方式给药治疗，每日 1 次，持续 1 个月对照 组给予 PBS0.2ml/d；met40 组给予二甲双胍 40mg/kg/d；met200 组给予二甲双 胍 200mg/kg/d观察药物干预过程中裸鼠的一般情况，每 4 天称量动物的体重， 测量移植瘤的长短径，以计算肿块大小治疗结束后，颈椎脱臼法处死荷瘤鼠， 剥离移植瘤及肺、心、脑、肝、肾等脏器，以 HE 染色观察肿瘤及各器官的形态， 判定肿瘤有无远处转移；以免疫组化染色检测各组移植瘤内 Ki-67 的表达情况； 以 TUEL 染色原位检测肿瘤细胞的凋亡情况试验重复 2 次 结果：(1)以 A549 细胞接种于裸鼠右侧腋背部皮下，成功构建了肺腺癌的裸鼠皮下移植瘤模 型在为期 1 个月的药物干预过程中，各组裸鼠的一般状态良好，无明显异常 表现，未见明显药物毒副反应2)在药物干预的不同时间测量移植瘤的大小， 均以对照组的肿瘤体积最大，met40 组其次，met200 组的肿瘤体积最小药物 干预 1 个月后，两个二甲双胍治疗组的移植瘤平均体积均显著小于对照组 (P＜0.01)；以对照组为参照，40mg/kg/d 和 200mg/kg/d 剂量的二甲双胍腹腔 注射给药对裸鼠移植瘤生长的抑制率分别为 19.81％±6.25％和 40.70％±8.98％。

3)对移植瘤标本行免疫组化染色结果显示，met40 和 met200 组肿瘤内 Ki-67 抗原的阳性表达率分别为 38.80％±10.41％和 32.85％±10.14％，均显著低于对照组(58.18％±12.83％)(P＜0.01)4) TUNEL 染色结果显示，对照组肿瘤内仅可见散在的凋亡细胞(3.1±1.8 个/HPF)， 而 met40 组和 met200 组肿瘤内的凋亡细胞数量显著增加(分别为 13.6±3.41 个 /HPF 和 16.35±3.07 个/HPF)(P＜0.01)，以后者增加更为明显 结论：40mg/kg/d 和 200mg/kg/d 两种浓度的二甲双胍均可有效的抑制肺腺癌裸鼠皮下 移植瘤的生长速度，使肿瘤细胞的凋亡增多、增殖活性减弱，且不会引起明显 的毒副反应，提示二甲双胍对于肺腺癌患者的治疗具有较好的临床应用前景 通过上述研究，得到结论如下： 1、二甲双胍可以通过阻滞细胞周期于 G1 期， 并诱导细胞凋亡，从而抑制肺腺癌细胞的体外增殖；二甲双胍与顺铂联用可增 强对肺腺癌细胞的生长抑制作用 2、JNK/p38 MAPK--Caspase 信号传导通 路参与了对二甲双胍诱导的肺腺癌细胞凋亡的调控，阻断 JNK/p38 MAPK 通路可 以部分地降低二甲双胍作用下肺腺癌细胞的早期凋亡率。

3、二甲双胍可以 诱导肺腺癌细胞内 GADD153 基因及蛋白表达增高，从而促进细胞凋亡 4、 二甲双胍腹腔注射给药可以抑制肺腺癌裸鼠皮下移植瘤的生长，降低肿瘤细胞 的增殖活性、促进细胞凋亡，且无明显毒副反应正文内容正文内容第一部分二甲双胍对肺腺癌细胞体外增殖的作用研究 目的：研究二甲双 胍对体外培养的肺腺癌细胞株的增殖、细胞周期、凋亡等方面的作用，观察二 甲双胍与顺铂联合使用对细胞生长的影响 方法：以 0、0.5、2、8mmol/L 四种浓度的二甲双胍分别对肺腺癌细胞株 A549 和 NCI-H1299 进行体外干预，在 第 0、24、48 和 72h，以 MTT 法检测各组细胞的增殖情况将上述各浓度的二 甲双胍与顺铂(10ug/mL)联用后，再次检测药物干预不同时间后细胞的活性变化 选取 A549 细胞株为主要研究对象，以二甲双胍干预 48h 后，采用流式细胞术检 测各组细胞在细胞周期及早期凋亡率等方面的差异 结果：(1)与对照组相 比，二甲双胍 2mmol/L 组和 8mmol/L 组细胞的增殖活性在药物作用 24h 后即明 显下降，以后者的下降更为明显；0.5mmol/L 组细胞在药物作用 48h 后也呈显 著的生长抑制。

随着干预时间延长，二甲双胍对各组细胞增殖的抑制更加显著 (2)二甲双胍与顺铂联合使用时，对肺腺癌细胞增殖的抑制作用较单用顺铂更强； 二甲双胍的浓度越高、对细胞干预的时间越长，该抑制作用越明显3)二甲双 胍干预 A549 细胞 48h 后，与对照组相比，0.5mmol/L 组细胞的周期分布及早期 凋亡率均无明显变化；2mmol/L 组 G1 期细胞所占比重显著增高(P＜0.05)，而 S 期细胞比重显著降低(P＜0.01)，细胞的早期凋亡率显著增加(P＜0.05)： 8mmol/L 组 G1 期细胞所占比重显著升高，S 期和 G2/M 期细胞则相应减少，细胞 的早期凋亡率也明显增高(均 P＜0.01) 结论：二甲双胍可以使细胞周期循 环阻滞于 G1 期，并诱导细胞的早期凋亡增加，从而有效抑制肺腺癌细胞株的体 外增殖，其作用呈浓度及时间依赖性增强；二甲双胍与顺铂共同作用可以增强 对肺腺癌细胞生长的抑制作用 第二部分 JNK/p38 MAPK-Caspase 信号传导 通路在二甲双胍诱导肺腺癌细胞凋亡中的作用研究 。