荧光分光光度计 原理.docx

分子荧光分析法基本要点：1. 理解分子荧光法的基本原理；2. 掌握分子荧光发射光谱的特；3. 了解荧光光谱仪的组成及各部分作用；4. 掌握分子荧光分析法的定量分析方法及主要应用范围发光光谱：物质分子或原子吸收辐射被激发后，电子以无辐射跃迁至第一电子激发态 的最低振动能级，再以辐射的方式释放这一部分能量而产生的光谱称为 荧光、磷光根据物质接受的辐射能量的大小及与辐射作用的质点不同，荧光分析法可分为以下 几种：1. X 射线荧光分析法用X射线作光源，待测物质的原子受激发后在很短时间内（10-8 S）发射波长在X 射线范围内的荧光2. 原子荧光分析法：待测元素的原子蒸气吸收辐射激发后，在很短的时间内（10-8 S），部分将发生辐射 跃迁至基态，这种二次辐射即为荧光，根据其波长可进行定性，根据谱线强度进行定量荧光的波长如与激发光相同，称为共振荧光 荧光的波长比激发光波长长，称为 StokeS 荧光；若短，称为反 StokeS 荧光3. 分子荧光分析法：有些物质的多原子分子，在用紫外、可见光（或红外光）照射时，也能发射波长在 紫外、可见（红外）区荧光，根据其波长及强度可进行定性和定量分析，这就是通常的（分子）荧光分析法。

基本原理」・分子荧光的发生过程（一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中, 成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=%+（-%）=0,其多重性 M=2S+1=1 （M为 磁量子数），因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂， 称“单线态”；图1单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C）当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常 它的自旋方向不改变，即S=0，则激发态仍是单线态，即“单线（重）激发态”；如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1： S=1/2+1/2=1其多重性：M=2S+1=3即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线（重）激发态”；“三线激发态”比“单线激发态”能量稍低但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态f单线态过程的10-6〜10-7二）分子去活化过程及荧光的发生：（一个分子的外层电子能级包括S0 （基态）和各激发态S]，S2，……，T]……，每 个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级）处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射 或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为：1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能 量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11〜10-13秒时间回到同一电子激发态 的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。

图2分子吸收和发射过程的能级图2. 内转换：当激发态S2的较低振动能级与S］的较高振动能级的能量相当或重叠时， 分子有可能从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S］的能量相等的振动能级上，这一 无辐射过程称为“内转换”内转换”过程同样也发生在三线激发态的电子能级间）3. 外转换：激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用（如碰撞）而以非辐射形 式转移掉能量回到基态的过程称“外转换”4•系间跨跃：当电子单线激发态的最低振动能级与电子三线激发态的较高振动能级相重 叠时，发生电子自旋状态改变的S—T跃迁，这一过程称为“系间跨跃”含有高原子序数的原子如Br2、12的分子中，由于分子轨道相互作用大，此过程 最为常见5. 荧光发射：当激发态的分子通过振动驰豫一内转换一振动驰豫到达第一单线激发态 的最低振动能级时，第一单线激发态最低振动能级的电子可通过发射辐射（光子）跃回 到基态的不同振动能级，此过程称为“荧光发射”如果荧光几率较高，则发射过程较快，需10-8秒它代表荧光的寿命）由于不同电子激发态（S）的不同振动能级相重叠时，内转换发生速度很快（容易）， 在10-11〜1013秒内完成，所以通过重叠的振动能级发生内转换的几率要比由高激发态发 射荧光的几率大的多，因此，尽管使分子激发的波长有短（九］）有长（九2），但发射 荧光的波长只有九3（＞人＞九2）。

6. 磷光发射：第一电子三线激发态最低振动能级的分子以发射辐射（光子）的形式回 到基态的不同振动能级，此过程称为 “磷光发射”磷光的波长九4较荧光的波长九3稍长，发生过程较慢约I〜10S）由于三线态 — 单线态的跃迁是禁阻的，三线态寿命比较长，（ 10-3~10s 左右），若 没其它过程同它竞争时，磷光的发生就有可能；由于三线态寿命较长，因而发生振动弛 豫及外转换的几率也高，失去激发能的可能性大，以致在室温条件下很难观察到溶液中 的磷光现象因此，试样采用液氮冷冻降低其它去活化才能观察到某些分子的磷光总之：处于激发态的分子，可以通过上述不同途径回到基态，哪种途径的速度快， 哪种途径就优先发生如果—发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比 较快，则荧光发生几率 高，强度大如果—发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比 较慢，则荧光很弱或不发 生三）荧光量子效率：物质发射荧光的光子数与吸收激发光的光子数的比值1)发射荧光的光子数吸收激发光的光子数①数值在0〜1之间他的大小取决于物质分子的化学结构及环境（toe、pH、溶 剂等）二. 激发光谱与荧光（发射）光谱1. 激发光谱：将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定荧光发射 波长，测定不同波长激发光下物质溶液发射的荧光强度（F）,作F—九光谱图称激发光谱。

从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长兀x选用兀x可得到强度最大 ex， ex的荧光2. 荧光光谱：选择九ex作激发光源，用另一单色器将物质发射的荧光分光，记录每一波ex长下的F作F-九光谱图称为荧光光谱荧光光谱中荧光强度最强的波长为xem九ex与入em 一般为定量分析中所选用的最灵敏的波长ex em三. 荧光与分子结构的关系1. 分子结构与荧光具有兀、兀及n、兀电子共轭结构的分子能吸收紫外和可见辐射而发生兀-兀*或 n -兀*跃迁，然后在受激分子的去活化过程中发生兀*-兀或兀*- n跃迁而发射荧光发生兀-兀*跃迁分子，其摩尔吸光系数（a）比n -兀*跃迁分子的大100—1000 倍,它的激发单线态与三线态间的能量差别比n -兀*的大的多，电子不易形成自旋反转， 体系间跨越几率很小，因此，兀-兀*跃迁的分子，发生荧光的量子效率高，速率常数大， 荧光也强所以一一只有那些具有兀-兀共轭双键的分子才能发射较强的荧光；兀电子共轭程度越大，荧光强度就越大（\x与xem长移）大多数含芳香环、杂环 ex em的化合物能发出荧光，且兀电子共轭越长，①越大2. 取代基对分子发射荧光的影响（1） （苯环上）取代 给电子基团，使兀共轭程度升高 荧光强度增加：如-ch3，-nh2， -OH，-OR 等。

2） （苯环上）取代吸电子基团，时荧光强度减弱甚至熄灭：如：，-COOH，-CHO, -NO2 ， -N=N-3） 高原子序数原子，增加体系间跨越的发生，使荧光减弱甚至熄灭如： Br， I 3. 共面性高的刚性多环不饱和结高的分子有利于荧光的发射例如：荧光素呈平面构型，其结构具有刚性，它是强荧光物质；而酚酞分子由于不 易保持平面结构，故而不是荧光物质• 溶液的荧光强度一. 荧光强度与溶液浓度的关系荧光是由物质吸收光能后发射而出，因此，溶液的荧光强度 F 和溶液吸收光能的 程度以及物质的荧光频率有关：F *（10-4）j F = K'（I0-It） ⑵K为常数，取决于荧光物质的量子效率①，根据L—B定律：—二 10 -Ebe ► I = I • ]0—£bcI t 00所以 F = K ( I0-I010-£bc) = K I0 ( l-10-£bc) = K I0 ( l-e-2.303£bc ) (3)将式中e-2.303£bc展开，得F = K' I (2.303 Ebe - (2.303 £ be )2 + (2.303 bc)3 +)⑷ 0 2! 3!当2.303£bC< 0.05时(浓度很小，溶液较稀时)，上式括号内第一项以后的各项均可忽略不计，所以：F= K'I 2.303E be (5)0对于一荧光物质的稀溶液，当 I0 及 b 一定时，F = Ke (6)即在低浓度(2.303sbc < 0.05)时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度呈(线性)正比关系。

二. 定量分析方法1. 工作曲线法： 配制一系列浓度梯度的待测物的标准溶液，同空白溶液，使样经过相同的处理之后分别测定荧光强度：Fs、FFx，然后作(Fs - F0)— e曲线，根据(F厂FJ,从工作 曲线上求得待测物的浓度(或含量)2. 直接比较法 ：如果荧光物质溶液的工作曲线通过原点，就可选择其线性范围，用直接比较法进行测定：F 二 FFs- F0 =弘，Fx- F0 = KCx ex 二亍二才-es ⑺s0三. 影响荧光强度的外界因素1. 激发光源：一般选用Xex最大ex但对某些易感光、易分解的荧光物质，尽量采用长波长，低 I0 及短时间光照2. 温度：大多数分子在温度升高时，分子与分子之间，分子与溶剂分子之间的碰撞 频率升高，非辐射能量转移过程升高，①降低，因此，降低温度，有利于提高①3. 溶液的pH：带有酸性或碱性环状取代基的芳香组化合物的荧光一般都与pH值有关，有些化合物在离子状态时不显荧光为此，在用荧光强度进行定量测定时，严格 控制溶液 pH 值是非常重要的4. 溶剂：对n—n共轭的荧光物质在极性溶剂中，AE减小/ -跃迁几率升高f -①f （波长长移）溶剂粘度J -①/5. 内滤：当荧光波长与荧光物质或其它物质的吸收峰相重叠时，将发生自吸收使荧光 物质的荧光强度下降，此现象称 “内滤” 。

6. 散射光的影响（溶剂的二种散射）（1） 瑞利散射光：物质（溶剂或其它分子）分子吸收光能后，跃迁到基态的较高振动 能级，在极短时间（10-12S）返回到原来的振动能级并发出和原来吸收光相同波长的光, 这种光称为瑞利散射光2） 拉曼散射光：物质分子吸收光能后，若电子返回到比原来能极稍高（或稍低）的 振动能级而发射的光称为拉曼散射光瑞利散射光波长与激发光波长相同，拉曼散射与激发光波长不同，而荧光物质的荧 光波长与激发光波长无关，因此可以通过选择适当的激发波长将拉曼散射光与荧光分 开7. 荧光熄灭剂的影响：荧光熄灭：荧光物质分子与溶液中其它物质分子之间作用导致荧光强度降低的现 象荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质如：X-，重金属离子、02 、硝基化物质、重氮化合物等尤其是溶液中的溶解氧能引起几乎所有的荧光物质产生不同程度的荧光熄灭现象， 因此，在较严格的荧光实验中必须除o28. 表面活性剂的影响：提高荧光强度• 测量荧光的仪器荧光计、荧光分光光度计的基本组成部件：激发光源、样品池、单色器、检测器、 显示系统1. 激发光源：要比吸收法中光源强度大汞灯：提供线光谱（光源强度随 变化大）碘钨灯：提供连续光谱 300~700nm.氙灯：提供连续光谱250〜700nm, 300〜400n。