大肠杆菌及菌落总数.docx

所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平 板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit, cfu)数，故 其单位应是cfu/g(mL)它反映的是检样中活菌的数量所谓大肠菌群，是指在37°C24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰 氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆 菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属水中大肠菌群的检验方法，常 用多管发酵法和滤膜法多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需 要时间长滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质 较多、易于阻塞滤孔的水样 三 ) 实验器材(1) 菌落总数的测定：1) 培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏 3.0 g 蛋白胨 lO.Og NaCl 5.0g 水 lOOOmL pH7.4 〜7.6将培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中，牛肉膏常 用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后到入烧杯也可放在称 量杯中，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然 后立即取出纸片。

在上述烧杯中先假如少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后， 加入琼脂，再在石棉上加热使其溶解将药品完全溶解后，补充水到所需的总体 积在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH,如果偏酸，用滴管向培 养基中逐滴加入lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用PH试纸测其PH，直至PH达 7.6反之，用lmol/LHCL进行调节无菌生理盐水：需用生理盐水浓度是0.9%：称取0.9克氯化钠，溶解在少量蒸 馏水中，稀释到100毫升2) 器材试剂：牛肉膏 蛋白胨 NaCl 1moL/LNaOH 1moL/LHCL 灭菌水高压蒸气灭菌锅 培养皿 三角烧瓶 带玻璃塞瓶 天平 试管 牛角匙 pH试纸(pH5.5-9.0) 棉花记号笔 纱布 吸管 麻绳 牛皮纸 量筒 玻璃棒 电热炉 称量杯 灭菌三角瓶 灭菌的具塞三角瓶 灭菌平皿 灭菌吸管 灭菌试管 高压蒸气灭菌：1.将内层锅去处，再向外层锅中加入适量的水，使水面与三角架相平为宜2.放回内层锅，并加入要灭菌的培养皿、试管、烧杯等物品（注 意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果）3.加盖，并将盖上的排气管插入内层的排气槽内，再2两两对称 的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

4•本实验用0.lMPa, 121.5°C, 20min灭菌灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至 “0”时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品2）大肠菌群的测定；1）培养基：① 乳糖胆盐蛋白胨培养基：蛋白胨20g,猪胆盐（或牛、羊胆盐）5g,乳糖10g,0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL, pH7.4制法：将蛋白胨、胆盐从乳糖溶于水中，校正pH,加入指示剂，分装，每 瓶50mL或每管5mL,并倒置放入一个杜氏小管，115C灭菌15min 双倍或三倍乳糖胆盐蛋白胨培养基：除水以外，其余成分加倍或取三倍用量② 伊红美蓝琼脂培养基：蛋白胨10g,乳糖10g, KHP0 2g, 2%伊红水溶液20M1, 0.65%美蓝水24溶液 lOmL,琼脂 17g,水 1000mL, pH7.1制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中，校正pH后分装.121C灭菌15min备用临用时加入乳糖并熔化琼脂，冷至50-55C,加入伊红和美蓝溶液，摇匀， 倾注平板③ 乳糖发酵管：除不加胆盐外.其余同乳糖胆盐蛋白胨培养基2） 器材：灭菌三角瓶,灭菌的具塞三角瓶,灭菌平皿,灭菌吸管,灭菌试管 等。

四）实验方法（1）水样的采集：1） 自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析2） 池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸边 5m 处，取距水面 10-15cm 的 深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻 璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出如果不能在 2h 内 检测的，需放入冰箱中保存2）细菌总数的测定：1） 水样稀释及培养：① 按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释：⑦根据对水样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度（饮用水如自来水、 深井水等，一般选择1、1:10两种浓度；水源水如河水等，比较清洁的可选择 1:10、 1:100、 1:1000三种稀释度；污染水—被选择1:100、 1:1000、 1:10000 三种稀释度），吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个重复③ 将熔化后保温度45°C的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL, 并趁热转动平皿混合均匀④ 待琼脂凝固后，将平皿倒置于37C培养箱内培养24±lh后取出，计算平 皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得ImL水样中所含的细菌菌落总数。

2） 计算方法：作平板计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏在记下各 平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数3）计数的报告：① 平板菌落数的选择：选取菌落数在 30-300 之间的平板作为菌落总数测定标准一个稀释度使用 两个重复时，应选取两个平板的平均数如果一个平板有较大片状菌落生长时， 则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数若片状菌 落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可计算半个平板后乘2 以代表整个平板的菌落数② 稀释度的选择：a. 应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以该稀释倍数报告之（表1 例1）b ．若有两个稀释度，其生长的菌落数均在 30-300 之间，则视二者之比如何 来决定若其比值小于2，应报告其平均数；若比值大于 2，则报告其中较小的 数字（l例2、例3）c. 若所有稀释度的平均菌落均大于300,则应按稀释倍数最低的平均菌落 数乘以稀释倍数报告之（1例4）d. 若所有稀释度的平均菌落数均小于30、则应按稀释倍数最低的平均菌落 数乘以稀释倍数报告之（1例5）e. 若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之（表 1例6）。

f. 若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以最接近30或300 的平均菌落数乘以该稀释倍数报告之（表1例7）③ 细菌总数的报告： 细菌的菌落数在100以内时，按其实有数报告；大于100时，用二位有效数 字，在二位有效数字后面的数字，以四舍五入方法修约为了缩短数字后面的0 的个数，可用 10 的指数来表示，如表 1“报告方式”一栏所示3）大肠菌群的测定（多管发酵法）：表 1 稀释度的选择及细菌数报告方式稀释度及菌落数两稀释度之比菌落总数/(cfu/g 或cfu/mL )报告方式（菌洛总数）/（ cfu/mL 或cfu/g）10-110-210-31多不可16420-1640016000 或 1.6X104计2多不可295461.63775038000 或 3.8X104计3多不可271602.22710027000 或 2.7X104计4多不可多不可313-313000310000 或 3.1X105计计527115-270270 或6 0 0 07 多不可 305 12计V10 V1O30500 31000 或 3.1X1041）生活饮用水或食品生产用水的检验：① 初步发酵试验：在2个各装有50mL的3倍浓缩乳糖胆盐蛋白胨培养液（可称为三倍乳糖胆盐） 的三角瓶中（内有倒置杜氏小管），以无菌操作各加水样100mL。

在10支装有5mL 的三倍乳糖胆盐的发酵试管中（内有倒置小管），以无菌操作各加入水样10mL 如果饮用水的大肠菌群数变异不大，也可以接种3份100mL水样摇匀后，37°C 培养 24h② 平板分离：经24h培养后，将产酸产气及只产酸的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美 蓝琼脂平板（EMB培养基）上，37C培养18—24h大肠菌群在EMB平板上，菌落 呈紫黑色，具有或略带有或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深； 挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检③ 复发酵试验： 将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗 漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落1—3个，37C培养24h， 如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在④ 报告：根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管数，查表 107-2（或表 107-3）， 报告每升水样中的大肠菌群数（MPN）2）水源水的检验：用于检验的水样量，应根据预计水源水的污染程度选用下列各量① 严重污染水：1，0. 1，0. 01. 0. 00lmL各1份② 中度污染水：10・1，0. 1，0. 01mL各1份。

③ 轻度污染水：100，10，1，0. 1mL各l份④ 大肠菌群变异不大的水源水：10mLl0份表 2 大肠菌群检索表（饮用水）012备注每升水样中大肠菌群数0V3411138182713273111838接种水样总量4142452300mL(1005183070mL2 份，106223692mL10 份)727431208315116193660230104069>230表 3 大肠菌群数变异不大的饮用水阳性管数0123接种水样总量每升水样中大肠菌群V3411>18300mL(3 份 100数mL)表 4 大肠菌群检索表（严重污染水）接种水样量/mL每升水样中备注10.10.010.001大肠菌群数----<900接种水样总---+900量为1.111--+-900（1，0.1，-+--9500.01，--++18000.001mL 各-+-+1900一份）-++-2200+---2300-+++2800+--+9200+-+-9400+-++18000++--23000++-+96000+++-238000++++>238000表 5 大肠菌群检索表（中度污染水）接种水样量/mL每升水样中大肠菌群数备注1010.10.01----<90---+90--+-90-+-。