第十一章动物基因工程.ppt

第十一章第十一章 动物基因工程动物基因工程1 第一节 基因工程概述 理论上的三大发现理论上的三大发现vDNA为遗传物质：为遗传物质：Avery的肺炎双球菌转化实的肺炎双球菌转化实验验vDNA双螺旋结构的发现和双螺旋结构的发现和DNA半保留复制机制半保留复制机制v遗传密码与中心法则遗传密码与中心法则2技术上的三大发明技术上的三大发明1.限制性内切酶和连接酶：限制性内切酶和连接酶：DNA的的“手术刀手术刀”与与“缝纫机缝纫机”2.载体：运送遗传物质的工具，如质粒、病毒载体：运送遗传物质的工具，如质粒、病毒等等3.逆转录酶：从逆转录酶：从mRNA到到 DNA，使真核基因，使真核基因制备成为可能制备成为可能345678910113、基因工程的内容、基因工程的内容v目的基因的获得目的基因的获得v目的基因与载体的连接成重组目的基因与载体的连接成重组DNA分子分子v重组重组DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞v筛选重组克隆筛选重组克隆 v基因表达与产物分离基因表达与产物分离12基因操作中的工具酶基因操作中的工具酶手术刀手术刀－限制性核酸内切酶、核酸外切酶－限制性核酸内切酶、核酸外切酶缝纫机缝纫机－连接酶－连接酶复印机复印机－－DNA聚合酶、逆转录酶聚合酶、逆转录酶第二节第二节  基因操作中的工具酶基因操作中的工具酶13      一、限制性内切酶的概述一、限制性内切酶的概述（一）（一）  概念概念 限制性核酸内切酶简称限制性内切酶，是一类限制性核酸内切酶简称限制性内切酶，是一类能识别双链能识别双链DNADNA中特定核苷酸序列并具有专一切割位点的中特定核苷酸序列并具有专一切割位点的脱氧核糖核酸水解酶。

脱氧核糖核酸水解酶 主要存在于细菌、霉菌中，至今已分离到主要存在于细菌、霉菌中，至今已分离到10001000种以种以上，搞清识别序列的有上，搞清识别序列的有300300种以上14（二）限制性内切酶（二）限制性内切酶命名规则命名规则        限制酶的命名从其来源微生物的拉丁名中摘限制酶的命名从其来源微生物的拉丁名中摘取，即由其属名的第一个字母取，即由其属名的第一个字母(大写大写)与种名的第一、与种名的第一、二两个字母二两个字母(小写小写)组成酶的基本命名，若酶的产生组成酶的基本命名，若酶的产生菌由株系之分，则有菌由株系之分，则有4个或个或4个以上拉丁字母组成，个以上拉丁字母组成，其第四个字母之后表示株系其第四个字母之后表示株系 如如       EcoRI来源于来源于Echerichia.coli RY13            BamHI来源于来源于B15H in d IIHaemophilus(属名属名)Influenzae(种名种名)d(株系株系)罗马数字罗马数字限限制制性性内内切切酶酶命命名名举举例例16 类别类别反应必须因子反应必须因子专一性专一性 活性活性 I型型S-腺苷基蛋氨酸，腺苷基蛋氨酸，ATP，，Mg2+识别部位和切点不同，识别部位和切点不同，无特定切割位点无特定切割位点内切内切甲基化甲基化 II型型Mg2+切断识别部位或其附近切断识别部位或其附近的特定部位的特定部位只有限制酶只有限制酶活性活性 III型型ATP，，Mg2+识别部位和切点不同，识别部位和切点不同，但切断特定部位但切断特定部位内切内切甲基化甲基化（三）限制性内切酶分类（三）限制性内切酶分类1718 （四）（四） II 型限制性内切酶的特性型限制性内切酶的特性    （（1））II型限制酶的识别特异性型限制酶的识别特异性   回文识别序列回文识别序列 II型限制酶的识别序列大多是具有型限制酶的识别序列大多是具有 双重对称结构性结构双重对称结构性结构,或称或称回文序列回文序列  (Palindromic Sequence)19（（2））识识别别特特定定的的核核苷苷酸酸序序列列，，其其长长度度一一般般为为4－－8个核苷酸且呈二重对称。

个核苷酸且呈二重对称3））具具有有特特定定的的酶酶切切位位点点，，即即限限制制性性内内切切酶酶在在其其识识别别序序列列的的特特定定位位点点对对双双链链DNA进进行行切切割割，，由由此此产生特定的酶切末端产生特定的酶切末端20识别序列识别序列(位点位点)Ø双链双链DNA分子上分子上能识别的特定核能识别的特定核苷酸序列苷酸序列Ø被识别的碱基序被识别的碱基序列通常具有双轴列通常具有双轴对称性，即回文对称性，即回文序列序列(Palindromic Sequence) EcoREcoR I I 的识别序列的识别序列21二、二、 DNA聚合酶聚合酶（（一）一）DNADNA聚合酶聚合酶 (DNA Polymerase)(DNA Polymerase)的基本特性的基本特性 能够将脱氧核糖核苷酸连续地加到双链能够将脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNADNA分子引物链分子引物链的的3’-OH3’-OH末端催化核苷酸的聚合作用，而不发生引物从末端催化核苷酸的聚合作用，而不发生引物从膜版上的解离作用膜版上的解离作用 DNA-OHDNA-OH DNA-(DNA-(pdNpdN) )n n ＋＋ nPPinPPi dATPdATP，，dTTPdTTP，，dCTPdCTP，，dGTPdGTP，，MgMg2 2＋＋DNADNA聚合酶聚合酶22大肠杆菌大肠杆菌 DNA 聚合酶聚合酶 ⅠⅠ1．．E.coli DNA 聚合酶聚合酶 ⅠⅠ 的活性的活性①① 5‘--3’ DNA 聚合酶活性。

聚合酶活性②② 5‘--3’ 外切核酸酶活性外切核酸酶活性③③ 3'--5' 外切酶活性外切酶活性   232．．E.coli DNA 聚合酶聚合酶 ⅠⅠ 的用途的用途  ①① 利用利用 E.coli DNA 聚合酶聚合酶 ⅠⅠ 的的 5‘--3’ 外切外切核酸酶活性，可用切口平移法（核酸酶活性，可用切口平移法（nick translation ））标记标记 DNA ，，所有所有 DNA 聚合聚合酶中只有此酶有此反应酶中只有此酶有此反应  ②② 用于用于 cDNA 克隆中的第二链，即单纯的克隆中的第二链，即单纯的 DNA 聚合活性但由于具有聚合活性但由于具有 5‘--3’ 外切活性，现在外切活性，现在已不再使用，而改用已不再使用，而改用 Klenow 酶和反转录酶酶和反转录酶（详见后面）详见后面） ③③ 对对 3‘ 突出端的突出端的 DNA 作末端标记（交换或置作末端标记（交换或置换反应），但是此反应用换反应），但是此反应用 T4 或或 T7 DNA 聚合聚合酶效果会更好酶效果会更好 24（二）（二）Klenow DNA 聚合酶聚合酶 v无无5’→3’外切活性外切活性v有聚合活性有聚合活性v有有 3’→ 5’外切活性外切活性v由于没有由于没有 5'--3'外切活性，使用范围进一步扩大外切活性，使用范围进一步扩大25Klenow DNA 聚合酶用途聚合酶用途①① 补平补平 3’ 凹端凹端 DNA 。

②② 抹平抹平 DNA 3’凸端  ③③ 通过置换反应对通过置换反应对 DNA 进行末端标记进行末端标记 ④④ 在在 cDNA 克隆中合成第二链克隆中合成第二链 ⑤⑤ 随机引物标记随机引物标记⑥⑥ 应用于应用于 Sanger 双脱氧链末端终止法的双脱氧链末端终止法的 DNA 测测序 ⑦⑦ 应用于应用于 PCR 反应，现在已经被反应，现在已经被 Taq DNA 聚合聚合酶等取代酶等取代⑧⑧ 在体外诱变中，用于从单链模板合成双链在体外诱变中，用于从单链模板合成双链 DNA     26（三）（三）T4 噬菌体噬菌体 DNA 聚合酶聚合酶        T4 噬菌体噬菌体 DNA 聚合酶来源于聚合酶来源于 T4 噬菌体感噬菌体感染的染的 E.coli ，，分子量分子量114kDa  T4 噬菌体噬菌体 DNA 聚合酶与聚合酶与 Klenow 酶相似，但酶相似，但 3‘--5’ 外外切活性强切活性强 200 倍，且不从单链倍，且不从单链 DNA 模板上替换模板上替换引物，因此在诱变反应中更有用，诱变率约提高引物，因此在诱变反应中更有用，诱变率约提高 1 倍27（五）逆转录酶（五）逆转录酶逆逆转转录录酶酶是是一一种种有有效效地地转转录录RNA产产生生cDNA的的酶酶。

产产物物DNA称称cDNA，，即即互互补补DNA (complementary DNA)，，该该酶酶又又称称为为依依赖赖于于RNA的的DNA聚聚合合酶酶(RNA-dependent DNA polymerase)逆逆转转录录酶酶在在基基因因工工程程中中的的主主要要用用途途是是以以真真核核mRNA为为模模板板，，合合成成cDNA，，用用以以组组建建cDNA文文库，进而分离为特定蛋白质编码的基因库，进而分离为特定蛋白质编码的基因28（六）末端转移酶（六）末端转移酶v来源于小牛胸腺来源于小牛胸腺 v催化催化 dNTP 加于加于 DNA 分子的分子的 3‘ 羟基端羟基端 vdNTP 为为 T 或或 C ，，二价阳离子首选二价阳离子首选 CO 2+；；为为 A 或或 G 首选首选 Mg 2+ v对对 3‘ 羟基突出末端的底物作用效率最高羟基突出末端的底物作用效率最高 v在在 cDNA 或载体或载体 3‘ 末端加同聚尾用于克隆末端加同聚尾用于克隆 v用标记的用标记的 rNTP、、 dNTP 或或 ddNTP 来标记来标记 DNA 片段的片段的 3' 末端 29DNA聚合酶在基因工程中的用途：聚合酶在基因工程中的用途：1) DNA分子的体外合成分子的体外合成2) 体外突变体外突变3) DNA片段探针的标记片段探针的标记4) DNA的序列分析的序列分析5) DNA分子的修复分子的修复6) 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)等等 30三、三、 DNA连接酶与连接酶与DNA分子的体外连接分子的体外连接体外体外DNA片段的连接方式：片段的连接方式：（（1）用）用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段片段（（2）用）用T4DNA连接酶将平端的连接酶将平端的DNA片段连接起来片段连接起来（（3））先先在在DNA片片段段的的末末端端加加上上化化学学合合成成的的衔衔接接物物或或接接头头，，使使之形成粘性末端之后，再用之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来连接酶将它们连接起来。

注注意意：：1、、DNA连连接接酶酶不不能能连连接接两两条条单单链链的的DNA分分子子或或环环化化单单链链的的DNA分分子子，，被被连连接接的的 DNA链链必必须须是是双双螺螺旋旋DNA分子的一部分分子的一部分 用用于于将将两两段段乃乃至至数数段段DNA片片段段拼拼接接起起来来的的酶酶称称为为连连接接酶酶它它催催化化DNA 5’－－磷酸基与磷酸基与3’－羟基之间形成磷酸二酯键－羟基之间形成磷酸二酯键31具有具有3’-OH和和5’-P基团的缺口基团的缺口被被DNA连接酶封闭起来连接酶封闭起来如果缺失一个或数个核苷酸的裂口如果缺失一个或数个核苷酸的裂口 DNA连接酶则不能将它封闭起来连接酶则不能将它封闭起来注意：2、连接酶如果缺失一个或数个核苷酸的裂口如果缺失一个或数个核苷酸的裂口 DNA连接酶则不能将它封闭起来连接酶则不能将它封闭起来32四、四、 其他酶类其他酶类 1 1、、T T4 4多核苷酸酶多核苷酸酶T4 多多核核苷苷酸酸酶酶催催化化ATP的的  -磷磷酸酸基基转转移移至至DNA或或RNA片段的片段的5‘--未端在基因工程中主要用于：在基因工程中主要用于：1) 标记标记DNA片段的片段的5’- 端，制备杂交探针，端，制备杂交探针，2) 基因化学合成中，寡核苷酸片段基因化学合成中，寡核苷酸片段5‘-- 磷酸化，磷酸化，3) 用于测序引物的用于测序引物的5‘-- 磷酸标记。

磷酸标记332 2、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶碱碱性性磷磷酸酸酶酶的的功功能能是是去去除除DNADNA或或RNARNA 5＇＇-- 未未端端的的磷磷酸酸基基，，反反应应可表示为：可表示为： 碱性磷酸酶碱性磷酸酶5‘p DNA或或5’p RNA 5’－－HO DNA或或5’－－OH RNA碱性磷酸酶可用于：碱性磷酸酶可用于：1)去去除除DNADNA片片段段5‘磷磷酸酸，，以以防防止止在在重重组组中中的的自自身身环环化化，，以以提提高高重重组效率2)在在用用［［r-32P］］ATP标标记记DNADNA或或RNA的的5’--磷磷酸酸前前，，去去除除DNADNA或或RNARNA片段的非标记片段的非标记5’--磷酸34利利用用碱碱性性磷磷酸酸酶酶CIP防防止止载载体体的的再再环环化化pUC19SacIKpnISmaIBamHIXbaISalIPslISphIHind III对接DNA可通过凝胶电泳纯化靶DNA3’OH3’OH5”P5”P5”P5”P3’OH3’OH用T4噬菌体DNA连接酶连接去磷酸化的质粒与靶DNA3’OH3’OH3’OH3’OH用CIP去除5‘P限制性内切酶3’OH3’OH3’OH3’OH鉴定重组子：检查a互补能力的丧失情况核酸杂交对小量制备的质粒DNA进行酶切分析CIP：：牛小肠提取牛小肠提取BAP: 大肠杆菌提取大肠杆菌提取353、核酸酶、核酸酶 （（nuclease）） 核酸外切酶：可降解核酸外切酶：可降解dsDNA中或中或DNA-RNA中的中的一条链一条链核酸内切酶：可切割核酸内切酶：可切割DNA链中的单链链中的单链（（1））BAL31 核酸酶（核酸酶（BAL31 nuclease）：）：来源于交替单胞菌来源于交替单胞菌 ，主要活性为，主要活性为 3' 外切核酸酶外切核酸酶活性，可从线性活性，可从线性 DNA 两条链的两条链的 3' 端迅速去除端迅速去除单核苷酸，随后可从单链单核苷酸，随后可从单链 DNA 内部发挥缓慢的内部发挥缓慢的内切酶活性，形成截短了的平端双链内切酶活性，形成截短了的平端双链 DNA 分子分子（约占（约占 10-20%）以及带有约）以及带有约 5 个核苷酸突出个核苷酸突出单链的截短分子（约占单链的截短分子（约占 80-90%）。

对于所形）对于所形成的单链突出，可用成的单链突出，可用 DNA 聚合酶补平聚合酶补平  36（（2））Sl 核酸酶（核酸酶（S1 nuclease））         Sl 核酸酶来源于米曲霉，可降解单链核酸酶来源于米曲霉，可降解单链 DNA 或或 RNA ，，是一种单链核酸酶产生带是一种单链核酸酶产生带 5' 磷酸磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链，对的单核苷酸或寡核苷酸双链，对 dsDNA、、 dsRNA 和和 DNA:RNA 杂交体不敏感酶浓度杂交体不敏感酶浓度大时可完全消化双链，中等浓度可在切口或小缺大时可完全消化双链，中等浓度可在切口或小缺口处切割双链口处切割双链    该酶可用于分析该酶可用于分析 DNA:RNA 杂交体的结构，杂交体的结构，去掉双链核酸中突出的单链尾从而产生平末端，去掉双链核酸中突出的单链尾从而产生平末端，打开双链打开双链 cDNA 合成中产生的发荚环合成中产生的发荚环 37（（3）脱氧核糖核酸酶）脱氧核糖核酸酶 ⅠⅠ （（DNase ⅠⅠ））          DNase ⅠⅠ 来源于牛胰，是内切核酸酶，可来源于牛胰，是内切核酸酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链 DNA 。

在在 Mg 2+ 存在下，独立作用于每条存在下，独立作用于每条 DNA 链，链，且切割位点随机在且切割位点随机在 Mn 2+ 存在下，它可在两存在下，它可在两条链的大致同一位置切割条链的大致同一位置切割 dsDNA ，，产生平端或产生平端或 1-2 个核苷酸突出的个核苷酸突出的 DNA 片段 38（（4）核糖核酸酶）核糖核酸酶 A （（Ribonuclease A 或或 RNase A））          核糖核酸酶核糖核酸酶 A 来源于牛胰，为内切核酸酶，来源于牛胰，为内切核酸酶，可特异攻击可特异攻击 RNA 上嘧啶残基的上嘧啶残基的 3‘ 端可除去端可除去 DNA:RNA 中未杂交的中未杂交的 RNA 区，可用来确定区，可用来确定 DNA 或或 RNA 中单碱基突变的位置广泛用来中单碱基突变的位置广泛用来去除去除 DNA 样品中的样品中的 RNA       核糖核酸酶核糖核酸酶 A 商品制剂可能会污染其它酶商品制剂可能会污染其它酶（如（如 DNA 酶），使用前应加热使酶），使用前应加热使 DNA 酶失活 39第三节第三节 基因工程的载体基因工程的载体 将外源将外源 DNA 或基因携带入宿主细胞（或基因携带入宿主细胞（host cell））的工具称为载体。

的工具称为载体 一、基因工程一、基因工程载体的概念：载体的概念：40二、基因工程载体的分类：二、基因工程载体的分类：         基因工程载体决定了外源基因的复制、扩增、基因工程载体决定了外源基因的复制、扩增、传代乃至表达传代乃至表达目前已构建应用的基因工程载体主要有目前已构建应用的基因工程载体主要有Ø质粒载体质粒载体Ø噬菌体载体噬菌体载体Ø病毒载体病毒载体Ø人工构建的组合载体人工构建的组合载体41一、一、 细菌质粒载体细菌质粒载体质粒介绍：质粒介绍： 质粒质粒 (plasmid)是是能自主复制的双链环状能自主复制的双链环状DNA分子分子，，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在，一个它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在，一个质粒就是一个质粒就是一个DNA分子，其大小可从分子，其大小可从1 kb到到300 kb 质粒广泛存在于细菌之中，在某些蓝藻、绿藻和真菌质粒广泛存在于细菌之中，在某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒质粒细胞中也存在质粒质粒DNA的特点为：的特点为：（（1）双链环状；）双链环状；（（2）分子量很小；）分子量很小；（（3）自主或半自主复制；）自主或半自主复制；（（4）不同生物质粒中的基因种类不同。

不同生物质粒中的基因种类不同42 从从分分子子量量大大小小看看, 质质粒粒DNA只只占占细细胞胞染染色色体体组组的的一一小小部部分分，，一一般般约约为为1-3%，，但但却却编编码码着着一一些些重重要要的的非非染染色色体体控控制制的的遗遗传传性性状状质质粒粒赋赋予予寄寄主主细细菌菌一一些些额额外外的的特特性性，，包包括括抗抗性性特特征征，，代代谢谢特特征征，，修修饰饰寄寄主主生生活活方方式式等   由由质质粒粒DNA编编码码的的基基因因还还包包括括有有产产生生抗抗菌菌素素的的基基因因、、芳芳香香族族化化合合物物降降解解基基因因、、糖糖酵酵解解基基因因、、重重金金属属抗抗性性基基因、产生细菌素的基因因、产生细菌素的基因等等431．质粒的复制．质粒的复制          每个质粒都有一段每个质粒都有一段DNA复制复制起始位点的序起始位点的序列列，它帮助质粒，它帮助质粒DNA在宿主细胞中复制质粒的在宿主细胞中复制质粒的复制和遗传独立于染色体，但其复制和转录依赖复制和遗传独立于染色体，但其复制和转录依赖于宿主所编码的蛋白质和酶于宿主所编码的蛋白质和酶           通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为位定义为复制子复制子）。

 44 质粒拷贝数分为严谨型与松驰型严谨型质粒质粒拷贝数分为严谨型与松驰型严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约每个细胞中拷贝数有限，大约 1 ～几个；松驰型～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百质粒拷贝数较多，可达几百松驰型质粒松驰型质粒: 复制不需要质粒编码的功能蛋白，其复制不需要质粒编码的功能蛋白，其复制完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶复制完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶(如如DNA聚合酶聚合酶ⅠⅠ、、ⅢⅢ，依赖于，依赖于DNA和和RNA聚合酶聚合酶等等)来进行严紧型质粒严紧型质粒: 复制要求同时表达一个由质粒编码的复制要求同时表达一个由质粒编码的蛋白质蛋白质 2．质粒的拷贝数．质粒的拷贝数 45463．质粒的不相容性．质粒的不相容性           两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不不相容性相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时出现的现象限制系统时出现的现象          不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。

两个不相容性质粒在同一个细胞不能共存于同一宿主中两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒而不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一种质粒而不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子在大肠杆菌中现已发一个群体，一般具有相同的复制子在大肠杆菌中现已发现现 30 多个不相容群，如多个不相容群，如 ColE1 和和 pMB1 ，， pSC101 和和 p15A 474．转移性．转移性             质粒具转移性它是指在自然条件下，很质粒具转移性它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内它需要移动基因宿主内它需要移动基因 mob ，，转移基因转移基因 tra ，，顺式因子顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位及其内部的转移缺口位点点 nic可分为：可分为：1.转移转移2.带动转移带动转移 485、选择标记、选择标记         选择标记选择标记用于鉴别目标用于鉴别目标 DNA （（载体）的存载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。

在，将成功转化了载体的宿主挑选出来          抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记         49           氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌中克隆的质泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌中克隆的质粒载体带有该基因青霉素可抑制细胞壁肽聚糖粒载体带有该基因青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应           氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反应并催化分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反应并催化 β-内酰胺环水解，从而解除了氨苄青霉素的毒性内酰胺环水解，从而解除了氨苄青霉素的毒性1）氨苄青霉素抗性基因（）氨苄青霉素抗性基因（ampr））50（（2）四环素抗性基因（）四环素抗性基因（tetr））          四环素可与核糖体四环素可与核糖体 30S 亚基的一种蛋亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。

四环素白质结合，从而抑制核糖体的转位四环素抗性基因编码一个由抗性基因编码一个由 399 个氨基酸组成的个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞             pBR322 质粒除了带有氨苄青霉素抗质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外，还带有四环素抗性基因性基因外，还带有四环素抗性基因 51（（3）氯霉素抗性基因（）氯霉素抗性基因（Cm r, cat））         氯霉素可与核糖体氯霉素可与核糖体 50S 亚基结合并抑制蛋亚基结合并抑制蛋白质合成目前使用的氯霉素抗性基因来源于转白质合成目前使用的氯霉素抗性基因来源于转导性导性 P1 噬菌体（也携带噬菌体（也携带 Tn9）cat 基因编基因编码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白（每个亚基（每个亚基 23kDa）在乙酰辅酶在乙酰辅酶 A 存在的条存在的条件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合衍生物，使之不能与核糖体结合 52（（4 ）卡那霉素和新霉素抗性基因（）卡那霉素和新霉素抗性基因（kan r, neor））         卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。

都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成 卡那霉素卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶（酸转移酶（APH（（3‘））-ⅡⅡ, 25kDa））的基因，的基因，氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移从而干扰了它们向细胞内的主动转移          在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔，在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响保护宿主不受这些抗生素的影响 53二、质粒载体的种类二、质粒载体的种类 （一）克隆载体（一）克隆载体              克隆载体主要用于扩增或保存克隆载体主要用于扩增或保存 DNA 片片段，是最简单的载体段，是最简单的载体 克隆克隆载体必须具备的基本条件：载体必须具备的基本条件：Ø具有复制起点具有复制起点Ø具有抗菌素抗性基因具有抗菌素抗性基因Ø具有若干个限制酶单一识别位点具有若干个限制酶单一识别位点Ø具有较小的分子量和较高的拷贝数具有较小的分子量和较高的拷贝数54（（1)质粒载体质粒载体 pBR 322        pBR 322大大小小为为4361 bp，，由由人人工工改改造造而而来来，，有有一一个个复复制制起起点点、、一一个个抗抗氨氨苄苄青青霉霉素素基基因因、、一一个个抗抗四四环环素素基基因因、、多种限制酶切点（多种限制酶切点（36个），可容纳个），可容纳5kb左右外源左右外源DNA。

  优点优点:①①具具有有较较小小的的分分子子量量易易于于自自身身DNA的的纯纯化化及及克克隆隆载载体体的的纯纯化化②②具有两种抗菌素抗性基因可作转化子的选择记号具有两种抗菌素抗性基因可作转化子的选择记号③③具具有有较较高高的的拷拷贝贝数数且且经经氯氯霉霉素素扩扩增增后后，，每每个个细细胞胞中中可可累累计计1000－－3000个拷贝55The bacterial chromosome and bacterial plasmids, as shown in the electron microscope. Plasmid DNACircular structurePlasmid DNACircular structureBroken 56Broken cellThe use of plasmid pBR322 as a cloning vector, showing how insertion of foreign DNA causes inactivation of the tetracycline resistance gene, permitting easy identification of transformants containing the cloned DNA 57外外源源基基因因克克隆隆入入质质粒粒载载体体的的过过程程酶处理酶处理防止自防止自身环化身环化缺缺口口由由宿宿主主细细胞胞的的连连接接酶修复酶修复58DNA cloning using bacterial plasmidsE. ColichromosomePlasmidPurifyplasmid DNAPurifyhuman DNATreat with EcoR1 to cleave both human and bacterial DNA into different sized fragmentsInsulin geneIncubate E. coli cellsunder conditionswhere they will takeup plasmids fromthe mediumPopulation of plasmidscontaining differentsegments of human DNAPlasmid freeE. coliJoin fragmentsinto recombinantDNAs with DNAligaseRibosomalRNA 59（（2）） 质粒载体质粒载体pUC 18/19    这这对对载载体体由由2686bp组组成成，，带带有有pBR 322的的复复制制起起始始位位点点，，一一个个氨氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因和和一一个个大大肠肠杆杆菌菌乳乳糖糖操操纵纵子子 --半半乳乳糖糖苷苷酶酶基基因因(lacZ’ )的的调调节节片片段段，，一一个个调调节节lacZ’基基因因表表达达的的阻阻遏遏蛋蛋白白(repressor)的基因的基因lac I，，还有多个单克隆位点。

还有多个单克隆位点   由由于于pUC质质粒粒含含有有Ampr抗抗性性基基因因和和lac Z’ 基基因因，，可以通过颜色反应和可以通过颜色反应和Ampr对转化体进行双重筛选对转化体进行双重筛选 60多克隆多克隆位点位点质粒载体质粒载体pUC 19 在在pBR322基础上基础上构建的系列载体构建的系列载体Lac Z’ 半乳糖苷酶基因，在含半乳糖苷酶基因，在含Xgal培培养基上呈蓝色，插入外源养基上呈蓝色，插入外源DNA，，重组重组子培养呈白色子培养呈白色MSC 区区段段pUC优点：优点：q具有更小的分子具有更小的分子量，更高的拷贝量，更高的拷贝数；数；q适用于用组织化适用于用组织化学方法检测重组学方法检测重组子；子；q具有多克隆位点具有多克隆位点MSC区段，与区段，与M13mp8噬菌体噬菌体相同的克隆区段相同的克隆区段61（二）其他质粒载体（二）其他质粒载体1、低拷贝数载体、低拷贝数载体2、检测转录控制信号的载体、检测转录控制信号的载体3、表达载体：是在常规克隆载体的基础上衍生而、表达载体：是在常规克隆载体的基础上衍生而来的，主要增添了强启动子，以及有利于表达产来的，主要增添了强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件物分泌、分离或纯化的元件62噬菌体噬菌体  噬噬菌菌体体内内含含双双链链环环形形、、单单链链环环形形、、双双链链线线形形、、单单链链线线形形等等多多种种形形式式、、大大小小不不一一的的DNA，，最最常常见见的的是是双双链链线线形形DNA, 且感染率高。

且感染率高   0.02 - 0.3   m二、二、  噬菌体噬菌体(Bacterophage)载体载体63 噬噬菌菌体体的的形形态态 64  噬菌体噬菌体×275,000, Scanning electron 65λ噬菌体特性：噬菌体特性：Ø含有线性双链含有线性双链DNA分子，其长度为分子，其长度为48502 bp，，两端各有两端各有12个核苷酸组成的个核苷酸组成的5’端凸出的互补粘性末端凸出的互补粘性末端端(cohesive end, cos)，当，当λDNA进入宿主细胞进入宿主细胞后，互补粘性末端连接成为环状后，互补粘性末端连接成为环状DNA分子连接处分子连接处称之为称之为cos位点Øλ噬菌体为温和噬菌体，噬菌体为温和噬菌体，λDNA可以整合到宿主细可以整合到宿主细胞染色体胞染色体DNA上，以溶源状态存在，随染色体的复上，以溶源状态存在，随染色体的复制而复制制而复制66Øλ噬菌体能包装λDNA长度的75%-105%的外源DNA，约38～54 kb，即使不对λDNA进行改造，也允许承载5 kb大小的外源DNA片段带入受体细胞Ø λDNA上的D基因和E基因对噬菌体的包装起决定性作用，缺任何一种基因都将导致噬菌体不能包装。

在宿主(受体)细胞中积累大量供包装用的其它壳蛋白ØλDNA分子上有多种限制性内切酶的识别序列，便于用这些酶切割产生外源DNA片段的插入和置换但是有的酶在λDNA上有多个识别序列，有的识别序列位于必需基因区域，将影响外源DNA片段的插入和置换67  噬噬菌菌体体的的cos末末端端COS5’-CGGGGCGGCGACTCG-3’3’-GCCCCGCCGCTGAGC-5’5’-CG GGGCGGCGACTCG-3’3’-GCCCCGCCGCTGA GC-5’ COS非必须区非必须区长臂长臂(左左)短臂短臂(右右) －噬菌体－噬菌体 －噬菌体染色体组－噬菌体染色体组蛋白蛋白外壳外壳DNA －噬菌体－噬菌体COS末端末端连接（感连接（感染后）染后）裂解（包裂解（包装过程）装过程）68构建构建λ噬菌体载体的基本途径为：噬菌体载体的基本途径为：抹抹去去某某种种限限制制性性内内切切酶酶在在λDNA分分子子上上的的一一些些识识别别序序列列，，只只在在非非必必需需区区保保留留1-2个个识识别别序序列列。

若若保保留留1个个识识别别序序列列，，可可供供外外源源DNA插插入入，，若若保保留留2个个识识别别序序列列，，则则两两个个识识别别序序列列之之间间的的区区域域可可被被外源外源DNA片段置换片段置换‚ 用用合合适适的的限限制制性性内内切切酶酶切切去去部部分分非非必必需需区区，，但但是由此构建的是由此构建的λDNA载体不应小于载体不应小于38 kbƒ 在在λDNA分分子子合合适适区区域域插插入入可可供供选选择择的的标标记记基基因69λ噬菌体载体的主要类型噬菌体载体的主要类型插入型载体：插入型载体：    外外源源DNA克克隆隆到到插插入入型型载载体体分分子子上上，，会会使使噬噬菌菌体体的的某某种生物功能丧失效力种生物功能丧失效力.q 免免 疫疫 功功 能能 失失 活活 （（ inactivation  of  immunity function)q 大大肠肠杆杆菌菌 －－半半乳乳糖糖苷苷酶酶失失活活（（inactivation  of E.coli  -galactosidase)‚ 替换型载体替换型载体    载体载体DNA分子中有一段可以被替换的分子中有一段可以被替换的DNA片断片断70用用λ噬噬菌菌体体作作为为克克隆隆载载体体71 噬菌体噬菌体DNA的复制的复制（（1)感染早期，环形感染早期，环形DNA分子可以按分子可以按 形式从双向进行形式从双向进行复制；感染晚期，复制；感染晚期， 滚动复制。

滚动复制2)稳定整合到染色体稳定整合到染色体DNA上复制 噬菌体载体可以成功的应用来作为扩增外源基因拷贝数噬菌体载体可以成功的应用来作为扩增外源基因拷贝数的克隆载体，使外源基因得到最大限度的表达已经应的克隆载体，使外源基因得到最大限度的表达已经应用用 噬菌体载体实现基因克隆和表达的有噬菌体载体实现基因克隆和表达的有DNA连接酶、连接酶、 DNA聚合酶聚合酶I和聚合酶和聚合酶III   亚基等72基基因因工工程程的的主主要要目目的的是是通通过过优优良良性性状状相相关关基基因因的的重重组组，，获获得得具具有有高高度度应应用用价价值值的的新新物物种种为为此此，，须须从从现现有有生生物物群群体体中中，，根根据据需需要要分分离离出出可可用用于于克克隆隆的的此此类类基基因因这这样样的的基基因因通通常常称称之之为为目目的的基基因因目目的的基基因因主主要是要是结构基因结构基因目的基因：目的基因： Ø 纯度很高纯度很高Ø 片断大小适于重组操作片断大小适于重组操作 第四节第四节 获得真核生物目的基因的方法获得真核生物目的基因的方法73目的基因的获得方法目的基因的获得方法Ø 分离分离Ø 化学合成化学合成 74一、利用一、利用PCR法法获取目的基因获取目的基因1.PCR:polymerase chain reaction,聚合酶链式聚合酶链式反应，是反应，是80年代发展起来的新技术，是通过模拟体年代发展起来的新技术，是通过模拟体内内DNA复制的方式，在体外选择性地将复制的方式，在体外选择性地将 DNA 某个某个特殊区域扩增出来的技术。

特殊区域扩增出来的技术 摘要：摘要：      其过程与其过程与 DNA 复制一样有三个步骤：模板变复制一样有三个步骤：模板变    性，引物与模板复性，延伸性，引物与模板复性，延伸 752、、PCR 扩增，主要的是引物设计，引物设计需扩增，主要的是引物设计，引物设计需要遵循一定的原则要遵循一定的原则3、用于、用于 PCR 的的 DNA 聚合酶种类很多，性质聚合酶种类很多，性质各异，可以满足不同的实验需要各异，可以满足不同的实验需要4、、 PCR 技术应用广泛，可以通过技术应用广泛，可以通过 A/T 克隆、克隆、 UDG 克隆等方法介导克隆，还可以通过同源克隆等方法介导克隆，还可以通过同源重组、重组、 重叠延伸等方法介导定点诱变反向重叠延伸等方法介导定点诱变反向 PCR ，，反转录反转录 PCR 在基因操作中也扮演了在基因操作中也扮演了重要角色重要角色 PCR 技术还广泛应用于鉴定、技术还广泛应用于鉴定、诊断等领域诊断等领域 76（一（一 ）） PCR 的基本原理的基本原理              1．基本要素和扩增原理．基本要素和扩增原理    基本要素与基本要素与DNA复制的基本要素是一致的。

复制的基本要素是一致的待拷贝的待拷贝的 DNA 称为模板，它可以是双链称为模板，它可以是双链 DNA 也可是单链也可是单链DNA，，最后扩增得到的产物是双链状最后扩增得到的产物是双链状态的引物是态的引物是 DNA 复制的先锋，就象结晶过程复制的先锋，就象结晶过程中的晶核，引导中的晶核，引导 DNA 的合成在的合成在 PCR 扩增中扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物一般使用合成的寡核苷酸作引物DNA 聚合酶聚合酶是是 DNA 复制的动力，在复制的动力，在 dNTP 等底物存在时等底物存在时在引物的引导下沿着模板在引物的引导下沿着模板 DNA 合成互补的合成互补的 DNA 链 772．．PCR 扩增的步骤扩增的步骤         首先将模板首先将模板 DNA 置于置于 92℃℃ -96℃℃，进行，进行变性变性（（denaturation））处理，使处理，使 dsDNA 在在高温下解链成为高温下解链成为 ssDNA ，，且热变性不改变其化且热变性不改变其化学性质；然后学性质；然后退火退火（（annealing）） ，，将温度降将温度降至至 37℃℃ -72℃℃，使引物与模板的互补区相结合；，使引物与模板的互补区相结合；最后，在最后，在 72℃℃ 条件下，条件下， DNA 聚合酶将聚合酶将 dNTP 连续加到引物的连续加到引物的 3'-OH 端，合成端，合成 DNA ，，这个步骤称为这个步骤称为延伸延伸（（extension）。

这三个这三个热反应过程的重复称为一个循环，经过热反应过程的重复称为一个循环，经过 20-40 个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的 DNA 片段 7879PCR80PCR：：变性－退火－延伸变性－退火－延伸81（二）   PCR 反应体系 1．．缓冲液缓冲液    标准的缓冲液含标准的缓冲液含 10mM Tris·HCl ，， pH 为为 8.3-9.0（室温），而在延伸温度（（室温），而在延伸温度（72 ℃℃）下，）下，pH 值接近值接近 7.2 缓冲液中含有一种二价阳离子，缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用聚合酶的活性中心，一般使用 Mg2+ ，，有时使用有时使用 Mn2+ 一般以一般以 MgCl2 的形式提供，标准浓度为的形式提供，标准浓度为 1.5mM  Mg2+ 浓浓度的高低会影响扩增的特异性和产率缓冲液中度的高低会影响扩增的特异性和产率缓冲液中还含有还含有 50mM 的钾离子有些缓冲液中还加入的钾离子有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富含一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富含 G+C 模板的扩增效率。

模板的扩增效率 822．．脱氧核苷三磷酸（脱氧核苷三磷酸（dNTP））    脱氧核苷三磷酸是脱氧核苷三磷酸是 DNA 合成的底物，标准合成的底物，标准的的 PCR 反应体系中含有等摩尔浓度的反应体系中含有等摩尔浓度的 4 种种 dNTP ，，即即 dATP、、dTTP、、dCTP 和和 dGTP ，，终浓度一般为终浓度一般为 200mM（（即饱和浓度）即饱和浓度） dNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性 833．．引物引物    在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各 1mM ，，即即 1pmol/ml ，， 在在 100 μl 反应体反应体系中相当于系中相当于6x1013个分子如果个分子如果 5% 用于扩用于扩增增 1kb 的的 DNA 片段，可得到片段，可得到 3.3 μg 的产物，的产物，足以用于常规分析足以用于常规分析 844．．模板模板    模板的数量会直接影响扩增的效果对于一般模板的数量会直接影响扩增的效果对于一般的的 PCR 扩增，扩增，104至至107个模板分子可达到满个模板分子可达到满意的效果。

用人类或哺乳动物基因组意的效果用人类或哺乳动物基因组 DNA 进行进行扩增时，一般使用扩增时，一般使用 1μg DNA , 相当于单拷贝基相当于单拷贝基因有因有 3×105 个拷贝以酵母菌、细菌、质粒和个拷贝以酵母菌、细菌、质粒和 M13 噬菌体噬菌斑的噬菌体噬菌斑的 DNA 作模板时，要达到作模板时，要达到这么多拷贝数分别需要这么多拷贝数分别需要 10ng，，1ng，，1pg 和和 1% 噬菌斑 855．．DNA 聚合酶聚合酶  ①① Taq DNA 聚合酶聚合酶    来自嗜热古细菌的嗜热水生菌（来自嗜热古细菌的嗜热水生菌（Thermus aquaticus）），， Taq DNA 聚合酶分子量大小聚合酶分子量大小为为 94kDa ，，为单分子酶，在为单分子酶，在 75℃℃ 活性最强活性最强具有具有 5'-3' 合成活性和合成活性和 5'-3' 外切活性外切活性 , 但是但是无无 3'-5' 外切活性在外切活性在 95℃℃ 的半衰期为的半衰期为 40 分分钟启动 PCR 反应的能力很强，聚合速度快，反应的能力很强，聚合速度快，在在 72℃℃ 的聚合速度为每秒的聚合速度为每秒 30-100 碱基。

由碱基由于没有于没有 3'-5' 外切活性，在扩增过程中有外切活性，在扩增过程中有 8.9-11x10 -5 的错配几率的错配几率 86  ②②商用混合酶商用混合酶    为了提高扩增的保真度或扩增较长的为了提高扩增的保真度或扩增较长的 DNA 片段，将片段，将 Taq DNA 聚合酶的强启动能力和具聚合酶的强启动能力和具有有 3'-5' 外切活性的高温外切活性的高温 DNA 聚合酶的高持续聚合酶的高持续活性和校正功能结合起来，可以达到很好的效果活性和校正功能结合起来，可以达到很好的效果 87（三）（三） PCR反应程序反应程序 1．常规程序．常规程序预变性预变性 :  94-96℃℃ 几十秒至几分钟几十秒至几分钟变性：变性：94℃℃ 、、 30 秒钟秒钟退火：退火：50-65℃℃ 、、30 秒钟；秒钟；      25～～35 次循环次循环延伸：延伸： 72℃℃ 、、 1 分钟分钟72℃℃ 保持保持 3-7min4℃℃ 保存保存882．复性（退火）和延伸温度．复性（退火）和延伸温度        复性的温度是复性的温度是 PCR 扩增是否顺利的关键因素，扩增是否顺利的关键因素，通常在通常在 50-60℃℃ 之间。

具体的温度主要由引物之间具体的温度主要由引物的的 Tm 值决定延伸温度绝大多数设定为值决定延伸温度绝大多数设定为 72℃℃ 如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法温度设置成同一温度，变成二步法 PCR  893．反应时间．反应时间        变性步骤一般使用变性步骤一般使用 30 秒钟，如果模板的秒钟，如果模板的 G+C 含量较高，或直接用细胞做模板，变性时含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长复性时间有间可适当延长复性时间有 30 秒种一般是足够秒种一般是足够的延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用的延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用 1kb 用用 1 分钟来保证充足的时间分钟来保证充足的时间 904．循环次数．循环次数 v循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为贝数为 104～～105 数量级时，循环数通常为数量级时，循环数通常为 25～～35 次 v平台效应（平台效应（plateau effect）：）：PCR 扩增过程扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。

原因：底物和引物的浓度已经降低，的现象原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP 和和 DNA 聚合酶的稳定性或活性降低聚合酶的稳定性或活性降低 ，，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底 915．．PCR 反应液的配制反应液的配制          PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行常规方法与其它酶学反应一样，在的正常进行常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入最后加入 DNA 聚合酶早期的聚合酶早期的 PCR 仪没有带仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发防止水分蒸发      对于使用具对于使用具 3'-5' 外切活性的高温外切活性的高温 DNA 聚聚合酶时，有时会扩增不出产物在遇到这个问题合酶时，有时会扩增不出产物在遇到这个问题时，如果将反应成分分开配制，时，如果将反应成分分开配制，A 管含模板、引管含模板、引物和物和 dNTP ，，以及调整体积的以及调整体积的 H2O ，， B 管含管含缓冲液、缓冲液、DNA 聚合酶和水，然后再将两管溶液聚合酶和水，然后再将两管溶液混合起来，可较好地克服这个问题。

混合起来，可较好地克服这个问题 92         按照常规的方法配制反应体系，有时会出现按照常规的方法配制反应体系，有时会出现非特异性扩增的问题热启动（非特异性扩增的问题热启动（hot start））PCR操作方式可较好解决这一问题将操作方式可较好解决这一问题将 dNTP 、、缓冲液，缓冲液， Mg2+ 和和 primer 先配制先配制好，然后加入一粒蜡珠（如好，然后加入一粒蜡珠（如 Ampli Wax PCR Qam100），），加热熔化，再冷却，使蜡将溶液加热熔化，再冷却，使蜡将溶液封住，最后加入模板和封住，最后加入模板和 DNA 聚合酶等剩余成分聚合酶等剩余成分只有当只有当 PCR 反应进入高温阶段后，蜡层熔化，反应进入高温阶段后，蜡层熔化，所有反应成分才会混合在一起所有反应成分才会混合在一起 93（四）（四） PCR反应体系各成分的主要作用反应体系各成分的主要作用1、模板、模板DNA：：研究对象研究对象2、、Mg 2+:影响反应的产率和特异性影响反应的产率和特异性3、反应缓冲液：维持反应环境、反应缓冲液：维持反应环境4、、dNTPs：：原料，多，速度过快且易出错；原料，多，速度过快且易出错；  少，少，慢单精度可上升慢单精度可上升5、、TagDNA聚合酶：聚合作用，无纠错功能聚合酶：聚合作用，无纠错功能6、引物：引导起始合成、引物：引导起始合成94（五）（五） 循环条件的设定循环条件的设定1、变性、变性2、退火、退火3、延伸、延伸4、循环次数、循环次数95（六）（六） 引物设计原则引物设计原则通用原则：通用原则：1、引物长度：、引物长度：15－－30Nt为宜为宜2、引物碱基尽可能随机分布、引物碱基尽可能随机分布3、引物内部不应自身形成二级结构、引物内部不应自身形成二级结构4、两个引物之间不能形成互补结构、两个引物之间不能形成互补结构5、引物、引物3’末端与模板配对末端与模板配对96加酶切位点加酶切位点PCR引物设计引物设计v长度：互补序列大于长度：互补序列大于20，没有上限。

没有上限v3‘端绝对不能互补；端绝对不能互补；v两引物具有较好的协调性；两引物具有较好的协调性；v内部二级结构较少；内部二级结构较少；v加酶切位点是需要注意保护碱基长度；加酶切位点是需要注意保护碱基长度；v检测特异性；检测特异性；97（七）（七） PCR技术的应用技术的应用1、基因克隆、基因克隆2、不对称、不对称PCR与与DNA序列测定序列测定3、、 RT-PCR与与RNA分析分析4、基因的体外诱变与突变的检测、基因的体外诱变与突变的检测5、基因组研究、基因组研究98RT-PCR99基因文库基因文库(Gene library)(Gene library)包括包括cDNAcDNA文库文库( (cDNAcDNA   library)library)和和基因组文库基因组文库(Genomic library)(Genomic library) cDNAcDNA是指以是指以mRNAmRNA为模板为模板, ,经反转录酶催化合经反转录酶催化合成成DNADNA，，则此则此DNADNA序列与序列与mRNAmRNA互补，称为互互补，称为互补补DNADNA或或cDNAcDNA二、基因组文库的构建与基因克隆二、基因组文库的构建与基因克隆100 基因组基因组基因组基因组DNADNA文库文库文库文库 从生物组织细胞提取出全部从生物组织细胞提取出全部DNA ，，用物理方法或酶法将用物理方法或酶法将DNA降解成预期大降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体连接，小的片段，然后将这些片段与适当的载体连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组有一个基因组DNA片段与载体连接的重组片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各个含有基因组各DNA片段克隆的集合体，就称为片段克隆的集合体，就称为基因组基因组基因组基因组DNADNA文库文库文库文库。

如果这个文库足够大，能包含如果这个文库足够大，能包含如果这个文库足够大，能包含如果这个文库足够大，能包含该生物基因组该生物基因组该生物基因组该生物基因组DNADNA全部的序列，就是该生物完整全部的序列，就是该生物完整全部的序列，就是该生物完整全部的序列，就是该生物完整的基因组文库，能从这文库中钓取该生物的全部的基因组文库，能从这文库中钓取该生物的全部的基因组文库，能从这文库中钓取该生物的全部的基因组文库，能从这文库中钓取该生物的全部基因或基因或基因或基因或DNADNA序列101cDNAcDNA文库：文库：文库：文库：提取出组织细胞的全部提取出组织细胞的全部mRNA，，在体外在体外反转录成反转录成cDNA，，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，，并能并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库    cDNA文库和基因文库的不同之处在于，文库和基因文库的不同之处在于，cDNA文文库除去了库除去了mRNA拼接过程中除去的内含子等成分，便拼接过程中除去的内含子等成分，便于于DNA重组的使用。

其复杂性比基因文库低得多实重组的使用其复杂性比基因文库低得多实际为不包含内含子的基因组文库际为不包含内含子的基因组文库102DNA片断的部分酶解和全部酶解片断的部分酶解和全部酶解一个完整的基因文一个完整的基因文库应该包括目的生库应该包括目的生物体所有的基因组物体所有的基因组DNADNA 103第五节. 目的基因的获得Making a genomicDNA libraries with plasmid 1043种通用的鉴定方法：种通用的鉴定方法：Ø用标记的用标记的DNA探针做探针做DNA杂交杂交Ø用抗体对蛋白质进行免疫杂交用抗体对蛋白质进行免疫杂交Ø对蛋白质的活性进行鉴定对蛋白质的活性进行鉴定鉴定文库中带有目的序列的克隆的方法鉴定文库中带有目的序列的克隆的方法105用标记的用标记的DNA探针做探针做DNA杂交杂交3’5’5’3’变性、转膜变性、转膜3’5’5’3’加入标记探加入标记探针、杂交针、杂交3’5’3’5’探针探针***探针探针***放射自显影放射自显影在培养基上培养菌落在培养基上培养菌落菌落印在膜上菌落印在膜上菌落蛋白裸露出来菌落蛋白裸露出来一抗与一抗与裸露的蛋白结合裸露的蛋白结合二抗与一抗二抗与一抗结合结合显色显色找出阳性克隆找出阳性克隆传膜传膜裂解裂解加一抗加一抗洗去一抗，加二抗洗去一抗，加二抗洗去游离的二抗，洗去游离的二抗，加显色剂加显色剂 通过免疫反应进行基因文库的通过免疫反应进行基因文库的 筛选筛选106组建一个组建一个cDNA文库的步骤：文库的步骤：1)分离表达目的基因的组织或细胞分离表达目的基因的组织或细胞2)从组织或细胞中制备总体从组织或细胞中制备总体RNA和和mRNA3））第第一一条条cDNA链链的的合合成成，，第第一一条条互互补补DNA链链的的合合成成需需要要RNA模模板板，，cDNA合合成成引引物物，，逆逆转转录录酶酶，，4种种脱氧核苷三磷酸以及相应的缓冲液脱氧核苷三磷酸以及相应的缓冲液(Mg2+)等。

等4)第二条第二条cDNA链的合成链的合成5) cDNA的甲基化和接头的加入的甲基化和接头的加入6)双链双链cDNA与载体的连接与载体的连接107互互补补DNA的的合合成成原原理理mRNA分子的分子的3’末端都有末端都有poly(A)尾巴尾巴,可以与结合寡聚可以与结合寡聚核苷酸核苷酸[oligo(dT)]的惰性物质的惰性物质结合结合,并得以分离并得以分离①①12-20个寡聚核苷酸的个寡聚核苷酸的oligo(dT)作为引物，合成第作为引物，合成第一个一个cDNA链链②②随机引物法随机引物法切割常损失需要的切割常损失需要的cDNA形成发卡环的机理不清形成发卡环的机理不清楚楚第一条第一条cDNA第二条第二条cDNA108基因组基因组DNA文文库及库及cDNA文库的文库的建立建立109根据研究目的，选择克隆策略根据研究目的，选择克隆策略§控制基因表达的调控序列控制基因表达的调控序列§mRNA中不存在的特定序列中不存在的特定序列DNA libary蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列cDNA110碱碱基基对对1061071081091010玉米玉米人人果蝇果蝇酵母酵母物物 种种大肠杆菌大肠杆菌5×109bp3.5×109bp1.6×108bp1.4×107bp4×111 1967年年Khorana提提出出化化学学合合成成基基因因的的想想法法，，并进行了实践。

并进行了实践q  1979年年Khorana在在“Science”上上发发表表了了“一个基因的合成一个基因的合成”的著名论文的著名论文 三、基因的人工合成三、基因的人工合成   DNA 的化学合成的化学合成 112 DNA 的化学合成的化学合成       单单链链DNA短短片片段段的的合合成成已已成成为为分分子子生生物物学学和和生生物物技技术术实验室的常规技术实验室的常规技术Ø化化学学合合成成DNA分分子子是是把把新新的的脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷酸酸加加到到DNA双链的双链的5’端，而在细胞中端，而在细胞中DNA分子合成的方向恰恰相反分子合成的方向恰恰相反Ø整整个个DNA的的化化学学合合成成过过程程可可以以在在一一个个反反应应柱柱上上连连续续进进行行，，并且可以对合成过程进行计算机控制并且可以对合成过程进行计算机控制Ø目前常用的化学合成目前常用的化学合成DNA的方法是磷酰胺法的方法是磷酰胺法 合成的合成的DNA片段可用于连接成一个长的完整基因，用片段可用于连接成一个长的完整基因，用于扩增目的基因于扩增目的基因(PCR)、、引入突变、作为测序引物，还可用引入突变、作为测序引物，还可用于杂交。

于杂交113 目目的的基基因因能能否否有有效效地地导导入入受受体体细细胞胞，，取取决决于于是是否否选选用用合合适适的的克克隆隆载载体体,合合适适的的受受体体细细胞胞和和合合适适的的基基因因转转移移方法    基基因因克克隆隆的的受受体体细细胞胞，，从从实实验验技技术术上上讲讲，，是是能能摄摄取取外外源源DNA(基基因因)并并使使其其稳稳定定维维持持的的细细胞胞，，从从实实验验目目的的上上讲，是有理论研究价值和应用价值的细胞讲，是有理论研究价值和应用价值的细胞    基基因因工工程程发发展展到到今今天天，，从从原原核核到到真真核核细细胞胞，，从从简简单单的的真真核核如如酵酵母母菌菌到到高高等等的的动动植植物物细细胞胞都都能能做做为为基基因因工工程程的的受体细胞，受体细胞也不同受体细胞，受体细胞也不同, 所用的基因载体也不同所用的基因载体也不同第五节第五节 DNA体外重组与基因转移体外重组与基因转移114一、载体与目的基因的连接一、载体与目的基因的连接    *DNA 体外重组所需的材料：载体、目的基因、限制性体外重组所需的材料：载体、目的基因、限制性内切酶和连接酶内切酶和连接酶。

   *原核生物的载体有：质粒，原核生物的载体有：质粒，λ噬菌体等噬菌体等   *真核生物的载体有：动物病毒真核生物的载体有：动物病毒（一）粘性末端连接法（一）粘性末端连接法  1、相同限制酶切位点连接、相同限制酶切位点连接   同一限制性内切酶切割不同同一限制性内切酶切割不同的的DNA ，，具有相同粘性末端适合于具有相同粘性末端适合于 DNA片段与片段与DNA片段、载体与片段、载体与DNA 片段的连接片段的连接  2、不同限制酶切位点连接、不同限制酶切位点连接  两种不同的限制性内切酶切割两种不同的限制性内切酶切割不同的不同的DNA片段，具有相同类型的粘性末端片段，具有相同类型的粘性末端115（二）平头末端连接（二）平头末端连接   1、、 粘性末端转化为平头末端粘性末端转化为平头末端   末端添补法和末端消除法，末端添补法和末端消除法，Kienow片段常用于末端补平，片段常用于末端补平，S1和和Bal31等核酸酶常用等核酸酶常用于末端消除于末端消除  2、连接效率低，一般只有粘性末端的、连接效率低，一般只有粘性末端的1%  3、提高效率的办法：增加目的、提高效率的办法：增加目的DNA片段和连接酶的浓度；片段和连接酶的浓度；（三）人工接头连接（三）人工接头连接  人工合成的具有特定限制性内切酶识别和人工合成的具有特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端切割序列的双股平端DNA短序列，将其接在目的基因片段和短序列，将其接在目的基因片段和载体载体DNA上，使它们具有新的内切酶位点。

上，使它们具有新的内切酶位点 （四）同聚物加尾连接（四）同聚物加尾连接  利用末端转移酶在利用末端转移酶在DNA 片段的片段的3‘末端末端添加同聚物造成延伸部分添加同聚物造成延伸部分 116 二、基因的转移二、基因的转移   重组体重组体DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞原核细胞、低等真核生物宿主原核细胞、低等真核生物宿主高等动、植物细胞宿主高等动、植物细胞宿主显微注射显微注射电电穿孔穿孔细胞学细胞学转化转化转导转导117 根根据据所所用用的的载载体体体体系系及及各各种种受受体体细细胞胞的的基基因因型型进进行行选选择择，，要要使使重重组组体体的的转转化化或或转转染染效效率率高高，，能能稳稳定定传传代代，，受受体体细细胞胞基基因因型型与与载载体体所所含含的的选选择择标标记记匹匹配配，，易易于于筛筛选选重重组组体体以以及及外外源源基基因因可可在在其其内内高高效效表表达达和稳定积累和稳定积累等 补充内容：受体细胞选择的一般原则补充内容：受体细胞选择的一般原则原核生原核生物物动物细动物细胞胞118目前已使用的受体细胞有三大类：目前已使用的受体细胞有三大类：（（1）微生物表达系统）微生物表达系统最最早早使使用用和和至至今今最最广广泛泛使使用用的的是是大大肠肠杆杆菌菌，，其其次次是是酵酵母母和和枯枯草杆菌。

草杆菌 （（2）植物细胞表达系统）植物细胞表达系统因因在在植植物物细细胞胞使使用用的的载载体体很很有有限限，，目目前前主主要要是是农农杆杆菌菌介介导导，，双子叶植物表达系统双子叶植物表达系统使用较多使用较多3）动物细胞表达系统）动物细胞表达系统哺哺乳乳动动物物细细胞胞主主要要是是胚胚胎胎细细胞胞和和培培养养的的体体细细胞胞，，但但培培养养条条件件苛刻，成本较高，且易污染苛刻，成本较高，且易污染昆昆虫虫细细胞胞既既能能表表达达原原核核基基因因，，又又可可表表达达哺哺乳乳动动物物基基因因，，且且有有较强的分泌能力和修饰能力较强的分泌能力和修饰能力119选用克隆载体时注意：选用克隆载体时注意：1)为为使使导导入入的的目目的的基基因因能能在在受受体体的的细细胞胞中中有有效效表表达，应选用具有强启动子的表达载体达，应选用具有强启动子的表达载体2)克克隆隆载载体体应应便便于于同同含含目目的的基基因因的的DNA片片段段进进行连接3)根根据据确确定定的的受受体体细细胞胞，，选选用用相相应应的的克克隆隆载载体体，，因因为为不不同同生生物物类类型型的的受受体体细细胞胞有有各各自自适适用用的的克克隆载体120 转化与转化转化与转化   把把纯纯化化的的外外源源DNA分分子子导导入入细细菌菌细细胞胞的的过过程程叫叫转转化化。

原原核核细胞的转化过程就是一个导入外源细胞的转化过程就是一个导入外源DNA的过程   把把以以噬噬菌菌体体或或病病毒毒为为载载体体的的重重组组DNA 分分子子引引入入受受体体细细胞胞的的过程叫做转染过程叫做转染  一一 般般 是是 将将 作作 为为 受受 体体 细细 胞胞 的的 细细 菌菌 放放 在在 一一 定定 浓浓 度度 的的 冰冰 冷冷CaCl2(50-～～100mmol/l)溶溶液液中中处处理理后后，，制制成成感感受受态态细细胞胞，，然后至于然后至于42℃℃高温热激高温热激90s的方法帮助其吸收外源的方法帮助其吸收外源DNA一）重组（一）重组DNADNA向细菌细胞导入向细菌细胞导入121 感感受受态态细细胞胞(competent cells)是是指指处处于于能能摄摄取取外外界界DNA分子的生理状态的细胞分子的生理状态的细胞为制备感受态细胞，应注意以下几点：为制备感受态细胞，应注意以下几点：(1)在在最最适适培培养养条条件件下下培培养养受受体体细细胞胞至至对对数数生生长长期期，，培培养养时时一一般控制受体细胞密度般控制受体细胞密度OD600在在0.4左右；左右；(2)制备的整个过程控制在制备的整个过程控制在0～～4℃℃(3)为提高转化率，可选用复合为提高转化率，可选用复合CaCl2溶液。

溶液122（二）外源目的基因向真核细胞导入（二）外源目的基因向真核细胞导入  1 1、借助于载体的基因转移、借助于载体的基因转移  真核生物以重组的动真核生物以重组的动物病毒或反转录病毒直接转染受体细胞物病毒或反转录病毒直接转染受体细胞    优点：定向性好，效率高，重复性好优点：定向性好，效率高，重复性好     缺点：载体的侵染范围有限，对一些经济性状缺点：载体的侵染范围有限，对一些经济性状（载体较大）的基因转移比较困难载体较大）的基因转移比较困难1232、磷酸钙或、磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染法葡聚糖介导的转染法   这这是是将将外外源源基基因因导导入入哺哺乳乳类类动动物物细细胞胞进进行行瞬瞬时时表表达达的的常常规规方方法   磷磷酸酸钙钙转转染染法法的的基基本本原原理理：：哺哺乳乳动动物物细细胞胞能能捕捕获获粘粘附附在在细细胞胞表面的表面的DNA-磷酸钙沉淀物，使磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞转入细胞    操操作作方方法法：：先先将将重重组组DNA同同CaCl2混混合合制制成成CaCl2-DNA溶溶液液，，随随后后形形成成DNA-磷磷酸酸钙钙沉沉淀淀，，粘粘附附在在细细胞胞表表面面，，通通过过内内吞作用进入受体细胞。

吞作用进入受体细胞 1243. 多聚物介导法多聚物介导法原原理理：：多多聚聚物物同同二二价价阳阳离离子子(如如Mg2+,Ca2+,Mn2+等等)和和DNA混混合合，，可可在在原原生生质质体体表表面面形形成成颗颗粒粒沉沉淀淀，，使使DNA进入细胞内进入细胞内常常用用试试剂剂：：聚聚乙乙二二醇醇(PEG)，，多多聚聚赖赖氨氨酸酸和和多多聚聚鸟鸟氨氨酸酸等等是是协协助助DNA转转移移的的常常用用多多聚聚物物，，尤尤以以PEG应应用用最广125应用对象应用对象：酵母细胞以及其它真菌细胞酵母细胞以及其它真菌细胞操操作作方方法法：：处处于于对对数数生生长长期期的的细细胞胞或或菌菌丝丝体体用用消消化化细细胞胞壁壁的的酶酶处处理理变变成成球球形形体体后后，，在在适适当当浓浓度度的的聚聚乙乙二二醇醇6000(PEG 6000)的的介介导导下下将将外外源源DNA导导入入受受体体细胞中1264. 原生质体融合法原生质体融合法    将将带带重重组组质质粒粒的的细细菌菌原原生生质质体体同同受受体体细细胞胞进进行行短短暂暂的的共共培培养，经过细胞膜融合，将重组养，经过细胞膜融合，将重组DNA导入细胞。

导入细胞 5. 脂质体介导法脂质体介导法    脂脂质质体体(liposome)是是由由人人工工构构建建的的磷磷脂脂双双分分子子层层组组成成的的膜膜状状结结构构，，把把用用来来转转染染的的DNA分分子子包包在在其其中中，，通通过过脂脂质质体体与与细细胞接触，将外源胞接触，将外源DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞原原理理：：细细胞胞膜膜表表面面带带负负电电荷荷，，脂脂质质颗颗粒粒带带正正电电荷荷，，以以电电荷荷间间引引力力将将DNA、、mRNA及及单单链链RNA导导入入细细胞胞内内该该法法的的优优点点是是稳定、温和稳定、温和1275. 显微注射法显微注射法   利利用用哺哺乳乳动动物物细细胞胞便便于于注注射射的的特特性性，，将将外外源源DNA分分子子通通过过显显微注射法直接注入细胞微注射法直接注入细胞 6. 粒子轰击法粒子轰击法(particle bombardment)    金金属属微微粒粒在在外外力力作作用用下下达达到到一一定定速速度度后后，，可可以以进进入入植植物物细细胞胞，，但但又又不不引引起起细细胞胞致致命命伤伤害害，，仍仍能能维维持持正正常常的的生生命命活活动动利利用用这这一一特特性性，，先先将将含含目目的的基基因因的的外外源源DNA同同钨钨、、金金等等金金属属微微粒粒混混合合，，使使DNA吸吸附附在在金金属属微微粒粒表表面面，，随随后后用用基基因因枪枪轰轰击击，，通通过过氦氦气气冲冲击击波波使使DNA随随高高速速金金属属微微粒粒进进入入植植物物细细胞胞，，此此方方法法可可直直接接处处理理植物器管或组织，是当今普遍应用的植物器管或组织，是当今普遍应用的植物转基因植物转基因方法。

方法1287. 高压电穿孔法高压电穿孔法   电电穿穿孔孔(electroporation)法法: 把把宿宿主主细细胞胞置置于于一一个个外外加加电电场场中，通过电场脉冲在细胞壁上打孔，中，通过电场脉冲在细胞壁上打孔，DNA分子随即进入细胞分子随即进入细胞原原理理：：细细胞胞膜膜(其其基基本本组组成成为为磷磷脂脂)，，在在适适当当的的外外加加脉脉冲冲电电场场作作用用下下，，细细胞胞膜膜由由于于电电位位差差太太大大而而呈呈现现不不稳稳定定状状态态，，从从而而产产生生孔孔隙隙使使高高分分子子（（如如ATP））和和低低分分子子物物质质得得以以进进入入细细胞胞质质内内，，但但还还不不至至于于使使细细胞胞受受到到致致命命伤伤害害，，当当移移动动外外加加电电场场后后，，被被击击穿穿的的膜膜孔可自行复原孔可自行复原    129高压电穿孔的操作条件高压电穿孔的操作条件1、、电电压压太太低低，，DNA不不能能进进入入细细胞胞膜膜；；电电压压太太高高，，细细胞产生不可逆损伤，故应在胞产生不可逆损伤，故应在300-600 V为宜；为宜；2、时间、时间20-100 ms；；3、、温温度度00C为为宜宜，，使使穿穿孔孔修修复复迟迟缓缓，，DNA进进入入机机会会多多应用对象：动物细胞，原核细胞。

应用对象：动物细胞，原核细胞 1308 .激光微束穿孔法激光微束穿孔法    利利用用直直径径很很小小、、能能量量很很高高的的激激光光微微束束可可引引起起细细胞胞膜膜可可逆逆性性穿穿孔孔的的原原理理，，用用激激光光处处理理细细胞胞，，处处于于细细胞胞周周围围的的重重组组DNA随随之进入细胞之进入细胞    此此方方法法适适用用于于活活细细胞胞中中线线粒粒体体和和叶叶绿绿体体等等细细胞胞器器的的基基因因转转移   基基因因导导入入的的方方法法多多种种多多样样，，可可根根据据具具体体要要求求进进行行选选择择，，具具体体操作也参考有关实验手册操作也参考有关实验手册131德国科学家转基因试验成功德国科学家转基因试验成功 小猪身上能发出绿光小猪身上能发出绿光 2003年年10月月27日日12:15 新华新华网网 　　　　新新华华网网柏柏林林10月月26日日电电（（记记者者潘潘治治））德德国国科科学学家家最最近近利利用用去去除除活活性性的的病病毒毒作作为为载载体体将将外外来来基基因因植植入入猪猪胚胚胎胎体体内内，，成成功功培培育育出出体体内内各各组组织织因因表表现现植植入入基基因因特特性性而而发发出出绿绿光光的的幼幼猪猪。

这这一一成成果果被认为对今后有目的地培养供人体所用的移植器官具有重要意义被认为对今后有目的地培养供人体所用的移植器官具有重要意义　　慕尼黑大学科学家亚历山大　　慕尼黑大学科学家亚历山大·普法伊费尔与埃克哈德普法伊费尔与埃克哈德·沃尔沃尔夫等人在夫等人在《《欧洲分子生物学组织通讯欧洲分子生物学组织通讯》》上发表论文说，他们在猪上发表论文说，他们在猪胚胎尚是单细胞阶段时就利用没有毒性的慢病毒作为载体，向其胚胎尚是单细胞阶段时就利用没有毒性的慢病毒作为载体，向其植入了一种名为植入了一种名为GFP的外来基因这种基因可以编码生成发出绿的外来基因这种基因可以编码生成发出绿光的蛋白质科学家们同时也给猪胚胎植入了一段人体光的蛋白质科学家们同时也给猪胚胎植入了一段人体DNA，，该该片断控制着皮肤细胞内某特定基因的活性片断控制着皮肤细胞内某特定基因的活性　　　　132他们认为，这是朝着有目的地植入基因以改变动物特性及培他们认为，这是朝着有目的地植入基因以改变动物特性及培养适用于人体的移植器官的重要一步养适用于人体的移植器官的重要一步通过有目的地植通过有目的地植入遗传物质，将来可以培养出适合人类接受、不产生排异入遗传物质，将来可以培养出适合人类接受、不产生排异反应的移植器官反应的移植器官”，沃尔夫说。

　　，沃尔夫说　　133目前重组体筛选的方法很多，概括起来有三类：目前重组体筛选的方法很多，概括起来有三类：（（1））生生物物学学方方法法：：包包括括遗遗传传学学方方法法、、免免疫疫学学方方法法和和噬噬菌菌斑斑的的形成等；形成等；（（2））核核酸酸杂杂交交：：通通过过DNA-DNA、、DNA-RNA碱碱基基配配对对的的原原理理进进行行筛筛选选，，以以探探针针的的使使用用为为核核心心，，包包括括原原位位杂杂交交、、Southen杂杂交交、、Northen杂交等杂交等；；（（3）物理方法：如用电泳法等物理方法：如用电泳法等第六节第六节 重组体的鉴定与筛选重组体的鉴定与筛选134一、遗传检测法一、遗传检测法（一）抗性筛选法：如（一）抗性筛选法：如pUC19、、pSK等能否质粒载体中都等能否质粒载体中都存在有氨苄青霉素的抗性基因，生长；蓝色和白色菌落，存在有氨苄青霉素的抗性基因，生长；蓝色和白色菌落，其中白色菌落可能含重组质粒其中白色菌落可能含重组质粒二）插入失活选择法（二）插入失活选择法   在载体上本来有一个正常表达的基在载体上本来有一个正常表达的基因，在这一基因中间有些多科隆位点，在没有外源因，在这一基因中间有些多科隆位点，在没有外源DNA插入时该基因可正确表达，当外源插入时该基因可正确表达，当外源DNA插入到基插入到基因这个中间时，该基因就不能正确表达，这种现象称为因这个中间时，该基因就不能正确表达，这种现象称为插入失活。

插入失活135二、重组质粒的快速提取与酶切鉴定二、重组质粒的快速提取与酶切鉴定136三、核酸分子鉴定法三、核酸分子鉴定法核酸杂交技术核酸杂交技术 （基于碱基互补配对）（基于碱基互补配对） SouthernSouthern杂交杂交 DNADNA片段片段 NorthernNorthern杂交杂交 RNARNA 原位杂交原位杂交137* 是是southern于于1975年创建用以鉴定年创建用以鉴定DNA中某中某一特定的基因片段的技术，也称为一特定的基因片段的技术，也称为Southern印迹（印迹（Southern Blot） 通过标记的探针通过标记的探针DNA与靶与靶DNA结合，检测目的基结合，检测目的基因的存在及大小因的存在及大小Southern杂交杂交138Northern杂交杂交* 也称为也称为Northern印迹（印迹（Northern Blot），），用以检测用以检测某一特定的某一特定的RNA（（通常是通常是mRNA））片段的存在及表片段的存在及表达量。

达量 因与因与DNA的杂交（的杂交（Southern 杂交）相对应，故被趣称杂交）相对应，故被趣称为为Northern杂交139原位杂交原位杂交* * 细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位细胞或染色体的原位杂交，用于基因定位 * * 细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆细菌菌落的原位杂交：筛选阳性克隆140四、四、Western(印迹印迹)杂交杂交* 蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹，即蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹，即检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合，经检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合，经放射自显影显示条带，根据条带密度确定蛋放射自显影显示条带，根据条带密度确定蛋白质表达量白质表达量 与与DNA、、RNA水平上的水平上的Southern杂交、杂交、Northern杂交相对应，称为杂交相对应，称为Western杂杂交 常结合常结合Northern印迹技术，检测基因表达调控印迹技术，检测基因表达调控141五、序列测定五、序列测定SangerSangerSangerSanger等（等（等（等（1977197719771977）发明的双脱氧链末端终止法发明的双脱氧链末端终止法。

发明的双脱氧链末端终止法发明的双脱氧链末端终止法142第七节第七节 转基因技术转基因技术（（Transgenic technology））143 转基因与转基因动物转基因与转基因动物速生长效应的速生长效应的““转基因超级鼠转基因超级鼠””转基因鼠比与转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快它同胎所生的小鼠生长速度快2 2～～3 3倍，体积大一倍，体积大一倍 转基因超级鼠转基因超级鼠1982年，英国的年，英国的《《自然自然》》杂志发表了一篇文章：杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠  生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中,培育出培育出具快速生长效应的具快速生长效应的“转基因超级鼠转基因超级鼠”转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快2～～3倍，倍，体积大一倍体积大一倍144转基因：转基因：1）将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由）将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，称之为转基因技术。

称之为转基因技术2）转基因技术就是指利用分子生物学技术，将某些生物的）转基因技术就是指利用分子生物学技术，将某些生物的基因转移到其它物种中，改造生物的遗传物质，使遗传物基因转移到其它物种中，改造生物的遗传物质，使遗传物质得到改造的生物在性状、营养和消费品质等方面向人类质得到改造的生物在性状、营养和消费品质等方面向人类需要的目标转变需要的目标转变转基因动物：转基因动物：       所谓转基因动物就是指以实验方法将外源基因导入动物所谓转基因动物就是指以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物一、概念一、概念1451、显微注射法：、显微注射法：将将DNA注射到胚胎的细胞核内，再注射到胚胎的细胞核内，再把注射过把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔成正常的幼仔  2、体细胞核移植方法：、体细胞核移植方法：先在体外培养的体细胞中进先在体外培养的体细胞中进行基因导入并筛选然后将带转基因体细胞移植到行基因导入并筛选然后将带转基因体细胞移植到去掉细胞核的卵细胞中，生产重构胚胎。

去掉细胞核的卵细胞中，生产重构胚胎转基因的方法转基因的方法146Microinjection of DNA in to the nucleus of a recently fertilized egg.The egg is held in place by a suction pipette shown at the bottom, while the injection pipette is shown penetrating the egg at the top.Transgenic mice. This photograph shows a pair of littermates at age 10 weeks. The larger mouse developed from an egg that had been injected with DNA containing the rat growth hormone gene placed downstream from a metal lothioein promoter. The larger mouse weights 44g; the smaller, uninjected control weighs 1473．逆转录病毒感染法：．逆转录病毒感染法：最早用来得到转基因小鼠的方法，最早用来得到转基因小鼠的方法，利用逆转录载体将遗传信息以利用逆转录载体将遗传信息以RNA分子的形式，在逆转分子的形式，在逆转录整合酶和逆转录基因组末端的特异性核酸序列的作用下，录整合酶和逆转录基因组末端的特异性核酸序列的作用下，反转录并整合到宿主基因组中去，最终得到转基因小鼠。

反转录并整合到宿主基因组中去，最终得到转基因小鼠4．胚胎干细胞法：．胚胎干细胞法：将转染的胚胎干细胞注射入受体囊胚腔，将转染的胚胎干细胞注射入受体囊胚腔，可参与嵌合体的形成，将来出生的动物的生殖系统就有可可参与嵌合体的形成，将来出生的动物的生殖系统就有可能整合上外源基因，通过杂交繁育得到纯合目的基因的个能整合上外源基因，通过杂交繁育得到纯合目的基因的个体，即为转基因动物体，即为转基因动物148  1、研究基因的结构与功能，了解动物生命现象、研究基因的结构与功能，了解动物生命现象的内在本质的内在本质  2、建立多种疾病的动物模型，研究发病机理及、建立多种疾病的动物模型，研究发病机理及治疗方法治疗方法  3、改善动物生产性能，提高动物育种效率改善动物生产性能，提高动物育种效率  4、作为医用或食用蛋白的生物反应器可以通、作为医用或食用蛋白的生物反应器可以通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白转基因动物的应用前景转基因动物的应用前景149 生物反应器是指利用转基因活体动物的某生物反应器是指利用转基因活体动物的某种能够高效表达外源蛋白的器官或组织来进行种能够高效表达外源蛋白的器官或组织来进行工业化生产活性功能蛋白的技术，这些蛋白一工业化生产活性功能蛋白的技术，这些蛋白一般是药用蛋白或营养保健蛋白。

般是药用蛋白或营养保健蛋白什么是生物反应器？什么是生物反应器？150生物反应器的种类及应用生物反应器的种类及应用 用于表达的生物反应器包括动物血液、泌用于表达的生物反应器包括动物血液、泌尿系统、精囊腺、乳腺等，还包括禽蛋和昆虫尿系统、精囊腺、乳腺等，还包括禽蛋和昆虫（例如家蚕）个体等例如家蚕）个体等 其中动物乳腺生物反应器是目前国际上唯其中动物乳腺生物反应器是目前国际上唯一证明可以达到商业化生产水平的生物反应器一证明可以达到商业化生产水平的生物反应器据预测，据预测，20102010年世界上动物乳腺生物反应器的年世界上动物乳腺生物反应器的年产值将达到年产值将达到500500亿美元以上亿美元以上151四个转基因作物种植大国四个转基因作物种植大国2002年数据年数据四个主要国家转基因作物种植面积占全球９９％四个主要国家转基因作物种植面积占全球９９％美国占６６％，达３９００万公顷，转基因作物产量也居世美国占６６％，达３９００万公顷，转基因作物产量也居世界第一，美国种植的７５％的大豆、３４％的棉花和７１界第一，美国种植的７５％的大豆、３４％的棉花和７１％的玉米都是转基因作物。

％的玉米都是转基因作物阿根廷占２３％，达１３５０万公顷阿根廷占２３％，达１３５０万公顷加拿大占６％，达３５０万公顷加拿大占６％，达３５０万公顷中国第四位，占４％，达２１０万公顷中国第四位，占４％，达２１０万公顷欧盟国家总面积不到２０万公顷，０欧盟国家总面积不到２０万公顷，０.３％左右３％左右 1521、食品安全问题：、食品安全问题：  1）未知的可能副作用？）未知的可能副作用？  2）外源基因在人体内表达？）外源基因在人体内表达？  2、技术问题：、技术问题：  1）成本；）成本；  2）成功率；）成功率；  3）基因组的有效整合、稳定遗传；）基因组的有效整合、稳定遗传；存在问题存在问题153第五节第五节 动物克隆技术动物克隆技术(Animal Cloning Technology)154Creating Dolly！！         1997年2月22日，英国“Nature”刊登了爱丁堡罗斯林研究所维尔穆特的研究成果，即“多莉”羊的克隆成功，从此震惊了世界155多莉的生命历程多莉的生命历程19981998年年4 4月与威尔士山羊戴维产下邦尼，证明了克隆动月与威尔士山羊戴维产下邦尼，证明了克隆动物也能生育。

物也能生育2003.2.142003.2.14日苏格兰向外界宣布：多莉因日苏格兰向外界宣布：多莉因早衰并患有肺炎，被迫实施了安乐死早衰并患有肺炎，被迫实施了安乐死由于早衰问题，由于早衰问题，人们人们怀疑疑““多莉是穿着羔羊服装的老羊多莉是穿着羔羊服装的老羊”” 156 罗斯林研究所科学家取一头普通白绵羊的乳腺细胞，将细罗斯林研究所科学家取一头普通白绵羊的乳腺细胞，将细罗斯林研究所科学家取一头普通白绵羊的乳腺细胞，将细罗斯林研究所科学家取一头普通白绵羊的乳腺细胞，将细胞核移植到一个剔除了细胞核的卵子中，使之融合、分裂、发胞核移植到一个剔除了细胞核的卵子中，使之融合、分裂、发胞核移植到一个剔除了细胞核的卵子中，使之融合、分裂、发胞核移植到一个剔除了细胞核的卵子中，使之融合、分裂、发育成胚胎，然后移植到第三头羊的体内科学家共培育育成胚胎，然后移植到第三头羊的体内科学家共培育育成胚胎，然后移植到第三头羊的体内科学家共培育育成胚胎，然后移植到第三头羊的体内科学家共培育277277277277个个个个胚胎，只有多莉成功出生胚胎，只有多莉成功出生胚胎，只有多莉成功出生胚胎，只有多莉成功出生。

1996199619961996年年年年7 7 7 7月月月月5 5 5 5日，多莉降临人世直日，多莉降临人世直日，多莉降临人世直日，多莉降临人世直到到到到1997199719971997年年年年2 2 2 2月月月月23232323日才公布于众日才公布于众日才公布于众日才公布于众157细胞核移植得到的个体都叫做细胞核移植得到的个体都叫做克隆克隆 核移植是指利用显微外科手术的方法将胚胎细胞或成体细胞核移植是指利用显微外科手术的方法将胚胎细胞或成体细胞的细胞核移人去核的卵母细胞中，构建成重组胚，通过体的细胞核移人去核的卵母细胞中，构建成重组胚，通过体内或体外培养、胚胎移植，产生与供体细胞基因型相同的内或体外培养、胚胎移植，产生与供体细胞基因型相同的后代的技术过程，又称为动物克隆技术根据核供体的来后代的技术过程，又称为动物克隆技术根据核供体的来源不同，可将其分为胚胎细胞克隆动物和体细胞克隆动物源不同，可将其分为胚胎细胞克隆动物和体细胞克隆动物技术通常所说的动物克隆指通常所说的动物克隆指体细胞克隆体细胞克隆，即动物的无性繁殖即动物的无性繁殖什么叫克隆？什么叫克隆？158克隆克隆动物的一般步骤动物的一般步骤v体细胞的采集和培养体细胞的采集和培养v采集卵细胞并去除卵细胞的细胞核采集卵细胞并去除卵细胞的细胞核v取出体细胞的细胞核取出体细胞的细胞核v用微注射法注入去除核的卵细胞中去用微注射法注入去除核的卵细胞中去v将重组胚细胞在体外进行适当培养将重组胚细胞在体外进行适当培养v将转核胚置入同期母体子宫，完成发育将转核胚置入同期母体子宫，完成发育159动物克隆的意义动物克隆的意义1、体细胞与胚胎干细胞的相互转化体细胞体细胞胚胎干细胚胎干细胞胞1602、对传统动物繁殖模式的挑战；、对传统动物繁殖模式的挑战；（（AI、、Clone））3、、对社会伦理的挑战；延续生命。

对社会伦理的挑战；延续生命4、保存物种多样性和濒临灭绝的动物、保存物种多样性和濒临灭绝的动物5、生产医用器官、动物生物反应器、生产医用器官、动物生物反应器6、转基因与动物克隆技术相结合，可降低生产成本转基因与动物克隆技术相结合，可降低生产成本161第九节第九节    基因诊断基因诊断         基因治疗基因治疗(gene therapy) 是指将人的正常是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用（也靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用（也包括剔除或抑制某些导致疾病的基因），从而达包括剔除或抑制某些导致疾病的基因），从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术到治疗疾病目的的生物医学新技术         基因疫苗基因疫苗指的是指的是DNA疫苗，即将编码外源疫苗，即将编码外源性抗原的基因插入载体，然后导入人或动物体内，性抗原的基因插入载体，然后导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导机体产生让其在宿主细胞中表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答免疫应答162         传统的基因治疗指目的基因导入靶细胞后与传统的基因治疗指目的基因导入靶细胞后与宿主细胞的基因组发生整合，成为宿主细胞遗传宿主细胞的基因组发生整合，成为宿主细胞遗传物质的一部分，目的基因的表达产物起到对疾病物质的一部分，目的基因的表达产物起到对疾病的治疗作用。

的治疗作用         目的基因不与宿主细胞基因组发生整合，暂目的基因不与宿主细胞基因组发生整合，暂时表达产物发挥治疗作用的基因治疗方法叫做基时表达产物发挥治疗作用的基因治疗方法叫做基因疗法因疗法(gene therapeutics)         广义的基因治疗还应包括基因调控，如利用广义的基因治疗还应包括基因调控，如利用RNAi技术抑制基因表达技术抑制基因表达163一、基因诊断的基本方法一、基因诊断的基本方法vDNA 分子杂交分子杂交v限制性内切酶酶谱分析限制性内切酶酶谱分析v限制性片段长度多态性的连锁分析限制性片段长度多态性的连锁分析 vPCR方法方法v寡核苷酸探针法寡核苷酸探针法164（二）基因芯片（二）基因芯片1、基因芯片简介、基因芯片简介2、基因芯片的种类、基因芯片的种类v诊断芯片诊断芯片v检测芯片检测芯片v表达谱基因芯片表达谱基因芯片3基因芯片的应用基因芯片的应用165生物芯片生物芯片 166生物芯片 167。