京尼平交联脱细胞牛心包生物支架材料实验探究.doc

京尼平交联脱细胞牛心包生物支架材料实验探究［摘要］目的:初步探讨新型生物交联剂京尼平对脱细胞牛 心包基质作为支架材料的影响及意义,为心肌组织工程心脏 补片的构建提供较理想的生物支架材料方法:实验分为三 组人组(25块)为新鲜未脱牛心包组织启组(25块)为脱细胞牛 心包组织,C组(25块)为京尼平交联的脱细胞牛心包组织采 用光学显微镜、扫描电镜观察脱细胞效果和胶原纤维、弹力 纤维改变;以组织厚度、热皱缩温度和抗拉力测试观察基质的 物理性能变化结果:光学显微镜、扫描电镜观察显示去污剂 ■酶消化法去细胞百分率达98.63%,能够有效脱除细胞，完整 保留牛心包组织的胶原纤维和弹力纤维;组织厚度测试结果 为,A 组(3.81.0) mm,B 组(3・81・2) mm,C 组(4.01・0) mm; 组织热皱缩温度测定结果为,A组(78.500.50)C,B组 (67.900.60)C,C组(85・900・40)9;组织抗拉力测试结果显 示，经交联剂京尼平处理后C组最大载荷、最大应力、弹性 模量、最大应变均高于A组，差异有统计学意义(P1.2新鲜牛心包的处理从养牛场采集新鲜成年牛心包，冰盐水保存运输,3~6 h后剔除心包表面残留的脂肪及其他结缔组织，然后4CD-Hanks液漂洗，随机分成三组:A组（25块）为新鲜未脱牛心 包组织,B组（25块）为脱细胞牛心包组织,C组（25块）为京尼 平交联的脱细胞牛心包组织;然后对B组（25块）和C组（25 块）采用去污剂■酶消化法处理获得脱细胞牛心包组织。

1.3 脱细胞支架材料的实验方法①将B组（25块）和C组（25块）牛心包浸入49、pH 8.0且含 0.05 mol/L NaCL 0.02% EDTA 和 100 klU/ml 抑肽酶 的 0.05 mol/L Tris-HCI 中 24 ho ②浸入 49、pH 8.0 且含1.5 mol/L NaCL 0.02% EDTA 和 100 klU/ml 抑肽酶的 0.05 mol/L Tris-HCI 中 24 ho ③4C,pH 7.4,D-Hanks 液清洗④用 4C、pH 7.4 且含 1 % Triton X-100. 0.02% EDTA 和 100 klU/ml 抑肽酶的 Tris-HCI 浸泡 24h⑤4C、pH 7.4、不含Mg2+. Ca2+的 D-Hanks 液清洗⑥37C、pH 7.6、含DNAasel(10 mg/L)% RNAaseA(1 mg/L)、Mg2+(3 mmol/L)、 Ca2+(1 mmol/L)的 10 mmol/L Tris-HCI 消化 1 ~2 h⑦4C、 pH 7.4、含 1 % Triton X-100 的 Tris-HCI 浸泡 24 ho ⑧4C、 pH 7.4 D-Hanks 液浸泡 48 ho1.4京尼平交联脱细胞牛心包组织C组（25块）采用含碘溶液[2]于379孵箱内作用48 h予以消毒，然后在379用0.625%京尼平溶液交联脱细胞的新 鲜牛心包组织72 h[3],磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗备用。

1.5检测项目 1.5.1组织学观察将A组、B组牛心包组织各5条置入10%甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋、切片、HE染色后在显 微镜下进行组织学观察和扫描电镜观察去细胞百分率=（新 鲜牛心包组细胞总数-去细胞组残留细胞数）/新鲜牛心包组细 胞总数1.5.2厚度、组织热皱缩温度测定A组、B组和C组牛 心包组织各取10片，裁成40 mmx5 mm试条,以蒸懾水为介 质，从室温开始，每分钟升高29,应用热收缩温度测定仪和 HD-10型厚度仪（精度0.01 mm）完成测试1.5.3机械力学测试将A、B、C组牛心包组织剪成5.0 cmxl.O cm矩形条块各10条，两边夹于材料性能试验机 （INSRON 5544材料性能试验机，太原理工大学生物力学实 验室），夹持间距为15 mmo以10 mm/min将管道壁组织向两 边拉伸，记录最大载荷、最大应力、最大应变和弹性模量1.6统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，数据用均数士标 准差（x士s）表示，组间两两比较采用t检验分析,三组间比较采 用单因素方差分析,P0.05）;热皱缩温度测定结果显示,C组分别与A组和B组比较，热皱缩温度差异有统计学意义(P京尼平是从梔子果实中提取的天然交联剂，它是一种环烯 醯菇类化合物，具有轻基、竣基等多个活性官能团。

京尼平 克服了常见交联剂在处理生物组织方面的缺点,无细胞毒性, 而且由其交联的生物组织在移植后不易钙化［10-1 1］o其可能 的交联机制如下:首先自发与氨基酸残基的自由氨基反应生 成一个环烯醞菇的氮化物，随后经过脱水作用形成一个芳香 族的单体,之后这一芳香族单体可能由于自由基反应的二聚 作用而形成环状的分子间和分子内交联京尼平交联的最佳 条件是:以0.625%为固定浓度,在中性条件下于室温固定交 联 3d［12］综上所述，采用去污剂-酶消化法处理后细胞数量极少，证 明本方法脱细胞效果良好;但抗拉负荷减小，经过新型生物交 联剂京尼平交联的脱细胞牛心包最大载荷增加显著,可以弥 补脱细胞牛心包力学性能的减少，为构建组织工程心脏补片 提供较理想的生物材料［参考文献］［1］邢万红，徐志伟•心肌组织工程研究新进展［J］•中华小儿 外科杂志,2006,27(4):207-209・[2] Moore MA, Phillips RE. Biocompatibility and immunologic properties of pericardial tissue stabilized by dye-mediated photooxidation [J]. J Heart Valve Dis,1997,6(3):307-315.[3] Ratner BD, Hoffman AS, Schoen FJ, et al. Biomaterial science [M]. San Diego: Academic Press, 1996:84-94.[4] Oei FB, Stegmann AP, Vander Ham F, et al. The presence of immune stimulatory cells in fresh and cryopreserved donor aortic and pulmonary valve allografts [J]. J Heart Valve Dis,2002,11(3):315-324.[5] Simon P, Kasimir MT, Seebacher G, et al. Early failure of the tissue engineered porcine heart valve synergraft in pediatric patients [J]. Eur J Cardio-thorac Surg,2003,23(6):1002-1006.[6] 郭铁芳•脱细胞基质与血管内皮细胞体外相容性的研 究[J]•中国修复重建外科杂志,2003,仃:165-168.[7] Courtman DW, Pereira CA, Kashef V, et al. Development of a pericardial acellular matrix biomaterial: biochemical and mechanical effects of cell extraction [J], Journal of Biomedical MaterialResearch, 1994,28(6):655-666.[8] 周建业，胡盛寿,任兵等•牛心包脱细胞基质的研制[J]・中国医学科学院学a,2001,23(2):193-195.[9] 陈强，吕伟娇,张文清•醛交联剂对壳聚糖复合膜性能的影响[J] •华东理工大学学报:自然科学)^,2005,31(3):398-402.[10] Nickerson MT, Farnworth R, Wagar E, et al. Somephysical and microstructural properties ofgenipin-crosslinked gelatin-maltodextrin hydrogels [J]. Intern ational Journal of BiologicalMacromolecules,2006,38(1):40-44.[11] Jin KH, Hwa LK, Joo JH, et al. Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract, geniposide and genipin [J]. Journal of Ethnopharmacology,2006,103(3):496-500・[12] Sung HW, Hsu HL, Shih CC, et al. Cross-linking characteristics of biological tissues fixed with monofunctional or multifunctional epoxy compounds [J]. Biomaterials,1996,17(14):1405-1413.(收稿日期:2009-12-21)。