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异源表达系统中蛋白质糖基化许 强 王克夷（中国科学院上海生物化学研究所，上海 200031）摘要 糖基化作为真核细胞中最为广泛的蛋白翻译后修饰方式，对糖蛋白的 分泌、抗原性、代谢等有重要的作用大多数药用蛋白均为糖蛋白近年来，在 糖生物学功能的研究，糖形的精确分析，以及糖基化生物合成的调控等方面，人 们已取得巨大进步本文主要探讨了不同异源表达系统中糖基化的优缺点关键词 糖基化；表达系统糖基化作为真核细胞中常见和复杂的翻译后修饰方式之一，有其重要的生物 学意义虽然不同糖蛋白中糖链的功能是不同的，但是由于糖链能修饰并改变蛋 白质的内在特性，从而对糖蛋白整体生物学功能的体现至关重要［1］另一方面， 基因工程技术的飞速发展，使人们有可能通过改变基因，来得到人们所需求的产 品目前，已有许多重组蛋白作为药物用于临床，然而绝大多数此类药用蛋白在 天然状态下为糖蛋白，或为在体内发挥药效必须被糖基化另外，为确保药物产 品的安全性、药效和均一性，研究和监控药用重组糖蛋白的糖基化形式也是必不 可少的事实上，美国食品和药物管理局（FDA）已经要求在申报人用糖蛋白类药 物时，须提供糖蛋白表面复杂糖形的分析结果［2］。

重组糖蛋白在异源系统中表达，虽用基因工程手段可直接改变蛋白质部分的 性质，然而由表达系统提供最优或最“忠实”反映药用糖蛋白糖形，则是一极其 复杂的问题在许多情况下，没有足够量的天然糖蛋白用于糖链结构的分析，此 问题就显得尤其突出糖链的合成与肽链是不同的，其合成是由糖基接受体、糖 基供体和糖基转移酶三者协调完成其中，糖基转移酶又居主导地位因此，每 一条糖链为一组糖基转移酶的催化产物，而一组酶又为一群基因的编码产物，也 即糖链同基因并非直接对应关系，故无法利用“模板”来推导糖链中糖基的顺序 另外，糖链又存在着不均一性，大多数情况下，这种不均一性反映了组织、细胞 类型、发育和分化阶段的不同；而培养条件（如培养基的组成）、下游加工过程中降解等因素，进一步导致了糖基化形式的多样性［3］因而，研究不同表达系统 和细胞培养条件等因素对糖基化的影响，就显得极其重要1 糖链的生物学功能近年来，随着糖链结构与功能研究的进展，人们对糖链生物学功能的了解越 来越深入例如，糖链能阻止基因工程表达的糖蛋白产物的聚集：在真核细胞中 表达的产物因带有复杂型(如哺乳动物细胞产物)或高甘露糖型(如酵母细胞产物) 糖链，蛋白可不发生聚合而分泌出细胞外；而在缺乏糖基化体系的大肠杆菌中表 达的非糖基化蛋白，则常聚集成不溶性包涵体形式存在，很少分泌出细胞，所以 糖蛋白表面的糖链有助于蛋白质的溶解，防止肽链聚集的作用。

又如，促红细胞 生成素(EPO)的天然来源十分有限，目前大多用基因工程的方法生产从人尿中提取的天然EPO在Asn24、Asn38和Asn83上各有一条N-糖链，且为四天线和部分三天线的复杂型N-糖链通过基因重组表达的EPO(rhEPO)，若NeuAc 完全或部分去除后，在体内能很快地被肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体摄取， 故而在体内几乎不体现活性，可见NeuAc对EPO在体内的半衰期影响极大另外，由某种中国仓鼠卵细胞(CHO)表达的二天线糖链的hEPO，即使糖链末端 被唾液酸化，在体内的活性仍极弱，远远低于四天线糖链的天然hEPOw因 为多分支结构的糖链可能参与防止小分子量糖蛋白渗出肾脏，或是作为从生成器 官肾脏到骨髓靶细胞间的“归巢”信号由此，可对治疗用糖蛋白生产得到如下 启示：末端糖基和糖链的分支结构，能显著地影响糖蛋白的体内生物学活性和半 衰期；而两者均可由宿主细胞选择来决定，但糖链的分支结构还可能依赖于蛋白 的序列所以，精心选择表达系统及严格控制培养条件，是保证重组糖蛋白体内 活性的关键因素根据已有实验证据来看，糖链影响糖蛋白的生物学功能，主要体现在以下方 面：(1)分子内：影响蛋白质的正确折叠、聚合，细胞内定位，蛋白的生物活性， 溶解度，免疫原性，生物半衰期，及对蛋白酶作用的抗性等；(2)分子间：参与 细胞内转运、定位，细胞间识别、粘附，与病原体的结合等。

2 影响蛋白糖基化的因素细胞中的蛋白质，即使经历相同的糖基化机制和分泌途径，也并非所有的潜在位点均可被糖基化，据估计有10%〜30%的潜在糖基化位点不能糖基化实 验进一步表明，不同类型N-糖链的分布也存在着糖基化位点的专一性如鼠脑 Thy-1蛋白，其Asn23仅能为高甘露糖型糖链，Asn74可为杂合型或复杂型糖链，而Asn98则能为任一种N-糖链⑸因此生物体内的确存在某些因素控制着蛋白质的糖基化，包括：(1)蛋白质的氨基酸序列决定着潜在糖基化位点的分布 和数目例如，EGF模体(motif)中恒定序列GGS/T常能被0-岩藻糖基化⑵在糖蛋白的生物合成过程中，糖蛋白的折叠方式，即蛋白质的三维空间结构，影 响糖基转移酶与蛋白表面特定序列的接触，从而引起糖链的延伸和添加糖基的不同 (3)合成糖蛋白细胞中糖基转移酶及相关酶类的表达类型 (4)细胞中不同糖 链加工区域的排列，以及糖链通过这些区域的速率从本文讨论的主题来看，因为前两点只影响糖基化的位点，后两点则可归结 为表达系统中细胞的类型和培养条件等因素，从而决定糖基化所形成的糖链结 构其中，细胞的类型也是决定糖基化程度和形式的主要因素在细胞中，多步 酶促反应组成了糖蛋白上糖链的加工过程。

而每个酶反应进行的不完全，又可能 形成糖链的各种糖形酶排列的方式，以及类型、浓度、动力学特性和分布等， 反应了细胞内蛋白糖基化的内外环境差异因此，重组蛋白的糖基化形式基本上 反映了所用表达系统的细胞类型，即不同细胞系产生的糖基化形式是有差异的3 异源蛋白表达系统中的糖基化3.1 细菌此表达系统中最为常用的是大肠杆菌和枯草杆菌(Bacillus subtilis)由于易 操作，获得量高，且基因背景、表达特性均很了解等因素，使得细菌表达系统成 为最受欢迎的异源蛋白表达系统之一虽然，最近发现如奈氏脑膜炎球菌(Neisseria meningitidis)等菌株中内源蛋白表面也有0-糖基化现象(结构不同于真核生物)［6］，但是常用的细菌表达株均无糖基化能力另外，已出现将几种关 键性的糖基转移酶克隆进大肠杆菌中共表达，重新构建重组糖蛋白表面糖链结构 的报道此方面的研究工作有希望产生新型的重组糖蛋白异源表达体系［7］3.2 丝状真菌大多数此类表达系统主要用于生产丝状真菌本身的内源性蛋白，如某些工业 用途或可食用的酶类虽然丝状真菌中许多蛋白质也能够糖基化，如丝状真菌分泌蛋白表面O-糖链大多连接一个Man,但是这一方面研究报道并不多。

另外，由于其较低的转化效率，基因背景了解不充分，以及细胞外大量分泌蛋白酶的存在，使得异源蛋白的表达较为困难3.3 酵母用酵母表达和分泌外源蛋白，一个主要难点是其N型和0型糖基化作用机 制不同于高等真核细胞例如，酵母表达的人甲状旁腺素尽管有全部的生物活性， 但其糖链修饰是酵母中特有的 0-甘露糖基化方式又如，人尿激酶-纤溶酶原激 活物中EGF样结构域，在天然产物和哺乳动物细胞中表达为特殊的0-岩藻糖基 化，而在啤酒酵母中表达无此现象［8］此外，酵母表达系统还可在蛋白糖链上 添加a 1,3甘露糖基，并因此抗原表位而在人体内引起强烈的免疫反应酵母表达系统对外源蛋白可能存在过度糖基化修饰方式，以及缺乏复杂型糖 链修饰，从而极大地影响了所表达糖蛋白的生物学功能为了改造酵母的糖基化 形式，现阶段主要采取二种措施：(1)位点专一性突变，减少潜在的糖基化位点；(2)利用酵母的突变株，如外周糖链生物合成缺陷型和a 1,3甘露糖基转移酶缺陷 型，产生类似哺乳动物的高甘露糖型糖链例如，过度甘露糖基化是绝大多数酵 母菌株共有的特征而一个甘露糖合成途径的双突变株，mnn 1mnn9,可表达非 免疫原性、非过度糖基化的重组蛋白［9］。

然而，由于此类突变体生长缓慢，目 前还不适于大规模工业化生产，故改造和发展这些菌株是今后的研究方向3.4 转基因植物利用外源基因导入植物表达系统，以植物作为“绿色工厂”生产药用蛋白的 前景是十分诱人的目前大多选用烟草和拟南芥菜作为植物表达系统的研究模 型，而N-糖链又是植物表达系统中研究较为详细的在植物中，序列子Asn-X-Ser/Thr中Asn,与哺乳动物一样，是作为N-糖链接受体但是，植物与哺乳动物在N-糖链的组成和结构上是不同的植物的 N-糖链仅包括高甘露糖型和复杂型，而无杂合型糖链并且大多数植物的复杂型 糖链仅含有Man、Fuc和Xyl,其连接方式也不同于哺乳动物，而与无脊椎动物 十分相似如植物复杂型糖链包括a 1-3Fuc,哺乳动物中主要为a 1- 6Fuc；另植物五糖核心结构上连接了0 1-2Xyl，而哺乳动物中无Xyl糖基修饰 方式植物所表达的糖蛋白在哺乳动物中有很高的免疫原性，可能与此二糖苷键 结构有关此外，哺乳动物细胞中存在着a 2,6唾液酸转移酶，而植物细胞无此 酶，故其糖链结构上也无唾液酸成分为了能够达到实际应用目的，避免产生高 免疫原性的复杂型糖链结构［10］，目前主要采取以下二种措施：(1)真核细胞中， 蛋白质C端若带有滞留信号H/KDEL,将截留在内质网腔内。

同样的，对植物中 表达的重组蛋白进行改造(使之带有滞留信号序列)，能让其留在内质网中，避免 进入高尔基体被植物系统糖基化；(2)利用基因工程技术，使植物高尔基体中糖 基转移酶突变(knockout)或增添新酶，然后让糖蛋白最终贮存在如液泡或非原质 体中3.5 昆虫细胞杆状病毒转染的昆虫细胞表达系统，由于杆状病毒载体的高产量，昆虫细胞 能以真核生物方式修饰重组蛋白，使该系统成为一个深受欢迎的重组糖蛋白表达 途径3.5.1 0-糖链据报道，Sf9细胞表达的重组人绒毛膜促性腺素0亚基(r-hCG P )，发现其与天然糖蛋白上唾液酸化的O-糖链不同：重组产物的糖链仅含有 Gal和GalNAc组成的中性二糖同样的，在Sf9细胞中表达的重组人白介素-2 和重组人a 2-干扰素，也仅发现Gal-GalNAc和GalNAc糖基因此，鳞翅蛉目 昆虫细胞能在哺乳动物细胞糖基化同一位点处进行 0-糖基化，但是目前仅发现 单糖和未唾液酸化的二糖结构3.5.2 N-糖链 到目前为止，绝大多数实验证据表明：昆虫细胞仅能表达高甘露糖型N-糖链(Man2 9GlcNAc2),并且昆虫细胞缺乏延长五糖核心结构生成复 杂型或杂合型糖链的能力［11］。

但是,也有不同于上述观点的报道例如，Davidson 等人在研究昆虫细胞表达重组人纤溶酶原(hPg )时，发现昆虫细胞也具有合成复 杂型糖链的能力［12］虽然存在着上述两种不同的结论，但有理由相信：昆虫细 胞很可能在转染杆状病毒之后，激活某些“沉寂”的糖基转移酶，使之加入重组蛋白的糖基化过程，从而产生不常见的糖链结构因此，得到恒定的复杂型糖链 表达株，使之成为具有发展潜力的药用重组糖蛋白表达系统，是目前主要的研究 方向3.6 哺乳动物细胞哺乳动物细胞株表达的重组产物，可带有复杂的糖链结构，和人源糖蛋白的 糖链结构较为相似，故成为目前主要的异源糖蛋白表达系统然而，哺乳动物细 胞株在糖基化的机制上，与人类组织仍然有显著的差异如，大多数哺乳动物细 胞表达a 1,3半乳糖基转移酶；而人类、类人猿中该酶基因已失活故某些鼠源 细胞株合成的末端Gala 1,3-Gal糖链，在人体内可引起免疫反应又如，成人 的糖蛋白上不含乙醇酰唾液酸(NeuGc),而在人-鼠杂交瘤细胞中含量则很高［13】 不过幸运的是， CHO 中不含上述二种糖基修饰方式，是一个较好的哺乳动物表 达系统另一方面，糖蛋白上糖链功能一旦确定，糖基化突变株将是表达所需糖链结 构的。