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总结-酵母酶活测定 2.9.3 β-Galactosidase 酶活定量试验参考Clontech Yeast Protocols Handbook进展 酵母酶活测定，打算：每个样品，8 ml 的YPD造就基，Y190 菌株〔转化用〕 Z buffer， Z buffer+beta-巯基乙醇， Z buffer+ONPG， NA2CO31) 打算5 ml SD/-Leu /-Trp液体造就基过夜造就的酵母菌，同时将ONPG溶解在Z缓冲液中〔4 mg/ml，调pH 7.0〕并振荡混匀1-2 hr；2) 旋涡振荡器上将菌液猛烈振荡0.5-1 min，马上取出2 ml参加8 ml的YPDA中；3) 30℃ 250 rpm摇3-5 hr，测OD600在0.5-0.8之间并记录准确OD值； 4) 取3个1.5 ml的EP 分别倒入1.5 ml菌液，14,000 rpm离心30 sec，当心弃上清，参加1.5 ml Z缓冲液，振荡以重悬菌体；5) 离心去上清，参加300 μl Z缓冲液重悬菌体〔那么浓缩倍数为1.5/0.3=5倍〕； 6) 取0.1 ml至新管中，液氮冷冻0.5-1 min，37℃ 0.5-1 min使其溶化； 7) 反复冻融3次以上使细胞尽可能破裂；8) 取一个新管参加101 μl Z缓冲液作为空白参照；9) 每管中参加0.7 ml Z缓冲液+β-巯基乙醇，参加160 μl 溶在Z缓冲液中的ONPG同时起先计时，将管置于30℃温浴；10) 当溶液变为黄色时，参加0.4 ml Na2CO3中止反响，计录反响时间t； 11) 14,000 rpm离心10 min，取上清，测OD420值； 12) 计算β-Galactosidase 酶活：β-Galactosidase units=1,000×OD420〔t×V×OD600〕 t为反响时间〔第10步记录〕 V为0.1×浓缩倍数〔第5步记录〕 OD600为第3步所测OD值2.9.4 提取酵母蛋白参考Clontech Yeast Protocols Handbook进展。

1) 接酵母菌于SD/-Leu /-Trp造就基中，30℃摇培过夜； 2) 扩培至50 ml YPDA造就基中，30℃摇培至OD600为0.4-0.6，计算总OD600值：测得的OD600值×造就液体积；3) 将菌倒入预冷的离心管中，4℃ 1010×g 5 min，弃上清，细胞重悬于50 ml预冷的超纯水中；4) 4℃ 1010×g 5 min，弃上清，冷的超纯水再洗一次，沉淀冻到液氮中，接着下面的试验或冻存于-80℃；5) 每7.5 OD600参加101 μl 60℃预热的裂解缓冲液〔用前参加PMSF和cocktail，因PMSF 有半衰期，需每隔7 min补一次〕，60℃水浴小于2 min使菌体溶化并重悬起来；6) 转移到1.5 ml的EP管中，参加适量glass beads〔80 μl/7.5 OD600〕，70℃ 10 min，猛烈振荡1 min；7) 4℃ 14,000 rpm离心5 min，将上清转移至新的EP管中并置于冰上；8) 沉淀置于101℃ 3-5 min，猛烈振荡1 min，4℃ 14,000 rpm离心5 min，当心吸取上清，并将两次的上清合到一起；9) 101℃ 10 min煮样，即可进展western blot。

试剂配置YPDA造就基：1 L配方：20 g Difo peptone，10 g Yeast extract，15 ml 0.2% adenine hemisulfate solution，加水至950 ml，灭菌后冷却至55℃再参加50 ml 40%的葡萄糖〔葡萄糖溶液可112℃灭菌或抽滤灭菌〕，假设为固体造就基灭菌前还需加20 g/L Agar；SD/-Leu /-Trp造就基：6.7 g/L Yeast nitrogen without amino acids，0.67 g/L -Leu /-Trp DO supplement，假设为固体造就基需加20 g/L Agar，灭菌；SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp造就基：6.7 g/L Yeast nitrogen without amino acids，0.6 g/L -Ade/-His /-Leu /-Trp DO supplement，假设为固体造就基需加20 g/L Agar，灭菌；贮存液：10×TE：0.1 M Tris-HCl，10 mM EDTA，调pH 7.5灭菌，10×LiAc：1 M LiAc，乙酸调pH 7.5灭菌， 50% PEG4000；PEG/LiAc：40% PEG，1×TE，1×LiAc；Z缓冲液：16.1 g/L Na2HPO4·7H2O，5.5 g/L NaH2PO4·H2O，0.75 g/L KCl，0.246 g/L MgSO4·7H2O，调pH 7.0并灭菌；Z缓冲液+β-巯基乙醇：101 ml Z缓冲液参加0.27 mlβ-巯基乙醇；裂解缓冲液：储存液：8 M尿素，5% SDS，40 mM Tris-HCl〔pH6.8〕，0.1 mM EDTA，0.4 mg/ml溴酚兰，运用前每毫升储存液参加10 μl β-巯基乙醇，并加蛋白酶抑制剂PMSF和cocktail。

2.10 酵母互补试验所用的载体为Dr. Hiten D. Madhani试验室〔University of California〕惠赠的p415-ADH1改造，用ADH1启动子驱动或将ADH1启动子换为酵母BRE1启动子，分别连接拟南芥的HUB1和HUB2基因，构建好的质粒转化酵母bre1Δ〔YM1740〕，空载体转化野生型YM1736〔S288C〕及bre1Δ〔YM1740〕作为参照，统计细胞体积大小参照Hwang et al.〔2003〕进展，大体流程如下：1) 将酵母菌接于SD/-Leu造就基中，30℃摇培至OD600 0.6-0.8； 2) 参加2%甲醛，30℃ 20 min固定；3) 离心收集菌体，用0.1 M的磷酸钾〔pH6.5〕洗2次； 4) 细胞重悬于1 ml P溶液中〔0.1 M的磷酸钾[pH6.5]，1.2 M山梨醇〕，4℃待用；取10 μl参加1 ml 0.1 M的磷酸钾〔pH6.5〕，用流式细胞仪统计细胞体积的大小，每个株系统计约3-5×104个细胞本文来源：网络收集与整理，如有侵权，请联系作者删除，谢谢！第5页 共5页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页第 5 页 共 5 页。