仪器分析第四版第三章.ppt

高效液相色谱法：高效液相色谱法：高效液相色谱法：高效液相色谱法： 特指一种用特指一种用特指一种用特指一种用液体为流动相液体为流动相液体为流动相液体为流动相的色谱分离分析方法它在的色谱分离分析方法它在的色谱分离分析方法它在的色谱分离分析方法它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 键合固定键合固定键合固定键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法一种液相色谱分析法一种液相色谱分析法一种液相色谱分析法 高压高压高压高压：：：：150-350*10150-350*105 5 PaPa 高速高速高速高速：迅速：迅速：迅速：迅速 高效高效高效高效：大于：大于：大于：大于3000030000塔板塔板塔板塔板/ /米米米米 高灵敏高灵敏高灵敏高灵敏：：：：1010-9-9g g （紫外检测）、（紫外检测）、（紫外检测）、（紫外检测）、1010-11-11g g （荧光检测）（荧光检测）（荧光检测）（荧光检测）第三章第三章 高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法 HPLC§3-1 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 一、一、HPLCHPLC与与GCGC差别差别 1 1．分析对象的区别．分析对象的区别．分析对象的区别．分析对象的区别 GC GC：：：： 适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、高沸点、挥发性差、高沸点、挥发性差、高沸点、挥发性差、 热稳定性差、离子型及高聚物热稳定性差、离子型及高聚物热稳定性差、离子型及高聚物热稳定性差、离子型及高聚物的样品，的样品，的样品，的样品，尤其对大多数生化样品不可检测尤其对大多数生化样品不可检测尤其对大多数生化样品不可检测尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的占有机物的占有机物的占有机物的20%20% HPLCHPLC：：：： 适适适适于于于于溶溶溶溶解解解解后后后后能能能能制制制制成成成成溶溶溶溶液液液液的的的的样样样样品品品品（（（（包包包包括括括括有有有有机机机机介介介介质质质质溶溶溶溶液液液液）））），，，，不不不不受受受受样样样样品品品品挥挥挥挥发发发发性性性性和和和和热热热热稳稳稳稳定定定定性性性性的的的的限限限限制制制制，，，，对对对对分分分分子子子子量量量量大大大大、、、、难难难难气气气气化化化化、、、、热热热热稳稳稳稳定定定定性性性性差差差差的的的的生生生生化化化化样样样样品品品品及及及及高高高高分分分分子子子子和和和和离离离离子子子子型型型型样样样样品均可检测品均可检测品均可检测品均可检测 占有机物的占有机物的占有机物的占有机物的80%80%2 2 2 2．操作条件差别．操作条件差别．操作条件差别．操作条件差别 GC GC GC GC：加温操作：加温操作：加温操作：加温操作 HPLCHPLCHPLCHPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）3 3 3 3．流动相差别的区别．流动相差别的区别．流动相差别的区别．流动相差别的区别 GCGCGCGC：：：：流流流流动动动动相相相相为为为为惰惰惰惰性性性性，，，，气气气气体体体体组组组组分分分分与与与与流流流流动动动动相相相相无无无无亲亲亲亲合合合合作作作作用用用用力，只与固定相有相互作用。

力，只与固定相有相互作用力，只与固定相有相互作用力，只与固定相有相互作用 HPLCHPLCHPLCHPLC：：：：流流流流动动动动相相相相为为为为液液液液体体体体，，，，流流流流动动动动相相相相与与与与组组组组分分分分间间间间有有有有亲亲亲亲合合合合作作作作用用用用力力力力，，，，能能能能提提提提高高高高柱柱柱柱的的的的选选选选择择择择性性性性、、、、改改改改善善善善分分分分离离离离度度度度，，，，对对对对分分分分离离离离起起起起正正正正向向向向作作作作用用用用改改改改变变变变流流流流动动动动相相相相极极极极性性性性和和和和pHpHpHpH值值值值也也也也对对对对分分分分离离离离起起起起到到到到调调调调控控控控作作作作用用用用，，，，当当当当选选选选用用用用不不不不同同同同比比比比例例例例的的的的两两两两种种种种或或或或两两两两种种种种以以以以上上上上液液液液体体体体作作作作为为为为流动相也可以增大分离选择性流动相也可以增大分离选择性流动相也可以增大分离选择性流动相也可以增大分离选择性又称又称又称又称 淋洗液、洗脱剂淋洗液、洗脱剂淋洗液、洗脱剂淋洗液、洗脱剂对流动相的要求：对流动相的要求：对流动相的要求：对流动相的要求：1 1）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈））使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈））使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈））使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈） 使用前过滤、纯化使用前过滤、纯化使用前过滤、纯化使用前过滤、纯化2 2）与固定液不反应，不引起柱效损失和保留特性变化）与固定液不反应，不引起柱效损失和保留特性变化）与固定液不反应，不引起柱效损失和保留特性变化）与固定液不反应，不引起柱效损失和保留特性变化3 3）对样品有良好溶解度）对样品有良好溶解度）对样品有良好溶解度）对样品有良好溶解度 k=1~10 k=1~10 k=2~5 k=2~5 最理想的最理想的最理想的最理想的4 4）与检测器匹配：）与检测器匹配：）与检测器匹配：）与检测器匹配： UV UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长） 荧光，电化学荧光，电化学荧光，电化学荧光，电化学流动相流动相 极性极性合适极性的流动相，组分保留时间适当合适极性的流动相，组分保留时间适当水水>甲酰胺甲酰胺>乙腈乙腈>甲醇甲醇>乙醇乙醇>丙醇丙醇>丙酮丙酮>二氧六环二氧六环>四氢呋喃四氢呋喃>甲乙酮甲乙酮>正丁醇正丁醇>醋酸乙酯醋酸乙酯>乙醚乙醚>异丙醚异丙醚>二氯甲烷二氯甲烷>氯仿氯仿>溴乙烷溴乙烷>苯苯>氯丙烷氯丙烷>甲苯甲苯>四氯化碳四氯化碳>二硫化碳二硫化碳>环己烷环己烷>己烷己烷>庚烷庚烷>煤油煤油可采用二元或多元组合的溶剂系统作为流动相，以获可采用二元或多元组合的溶剂系统作为流动相，以获得合适的溶剂强度（极性）得合适的溶剂强度（极性） 底剂：决定基本的色谱分离情况底剂：决定基本的色谱分离情况 洗脱剂：调节试样组分滞留并对某几个组分具有选洗脱剂：调节试样组分滞留并对某几个组分具有选 择性的分离作用择性的分离作用1 1．．．． 贮贮贮贮 液液液液 罐罐罐罐 （（（（ 滤滤滤滤 棒棒棒棒 ，，，， 可可可可 滤滤滤滤 去颗粒状物质）去颗粒状物质）去颗粒状物质）去颗粒状物质）2 2．高压泵（输液泵）、．高压泵（输液泵）、．高压泵（输液泵）、．高压泵（输液泵）、 梯度洗提装置梯度洗提装置梯度洗提装置梯度洗提装置3 3．进样装置．进样装置．进样装置．进样装置4 4．色谱柱．色谱柱．色谱柱．色谱柱————分离分离分离分离5 5．检测器．检测器．检测器．检测器————分析分析分析分析6 6．废液出口或组分收集器．废液出口或组分收集器．废液出口或组分收集器．废液出口或组分收集器 7 7．记录装置．记录装置．记录装置．记录装置一、高效液相色谱仪流程图一、高效液相色谱仪流程图§3-2高效液相色谱仪高效液相色谱仪液相色谱二二 高效液相色谱仪的主要部件高效液相色谱仪的主要部件1．泵：．泵：输送流动相，提高柱前压力，获得高速液流输送流动相，提高柱前压力，获得高速液流输送流动相，提高柱前压力，获得高速液流输送流动相，提高柱前压力，获得高速液流 压力一般为压力一般为压力一般为压力一般为15~35MPa15~35MPa 要求：流量稳定，压力平稳无脉动，流速可调要求：流量稳定，压力平稳无脉动，流速可调要求：流量稳定，压力平稳无脉动，流速可调要求：流量稳定，压力平稳无脉动，流速可调 恒压泵：流量精度不稳，如气动放大泵恒压泵：流量精度不稳，如气动放大泵恒压泵：流量精度不稳，如气动放大泵恒压泵：流量精度不稳，如气动放大泵 恒流泵：适用于梯度洗提，常用，如往复式柱塞泵恒流泵：适用于梯度洗提，常用，如往复式柱塞泵恒流泵：适用于梯度洗提，常用，如往复式柱塞泵恒流泵：适用于梯度洗提，常用，如往复式柱塞泵特特特特点点点点：：：：不不不不受受受受整整整整个个个个色色色色谱谱谱谱体体体体系系系系中中中中其其其其余余余余部部部部分分分分阻阻阻阻力力力力微微微微变变变变化化化化的的的的影影影影响响响响，，，，连连连连续续续续供供供供给给给给恒恒恒恒定定定定体体体体积积积积的的的的流流流流动动动动相相相相；；；；流流流流量量量量可可可可调调调调；；；；死死死死体体体体积小（适宜梯度洗提）；积小（适宜梯度洗提）；积小（适宜梯度洗提）；积小（适宜梯度洗提）；缺缺缺缺点点点点：：：：输输输输出出出出有有有有脉脉脉脉动动动动（（（（可可可可用用用用脉脉脉脉冲冲冲冲阻阻阻阻尼尼尼尼器器器器或或或或双双双双泵泵泵泵头头头头互互互互补补补补）））），，，，对紫外检测器影响不大对紫外检测器影响不大对紫外检测器影响不大对紫外检测器影响不大往往往往复复复复式式式式柱柱柱柱塞塞塞塞泵泵泵泵优优优优点点点点：：：：供供供供给给给给无无无无脉脉脉脉冲冲冲冲、、、、稳稳稳稳定定定定流流流流量量量量的的的的输输输输出出出出，，，，适适适适用用用用于于于于匀匀匀匀浆浆浆浆法法法法填填填填装色谱柱装色谱柱装色谱柱装色谱柱缺缺缺缺点点点点：：：：液液液液缸缸缸缸体体体体积积积积大大大大，，，，不不不不适适适适于于于于频频频频繁繁繁繁更更更更换换换换流流流流动动动动相相相相；；；；不不不不适适适适于于于于梯梯梯梯度洗提；补充溶剂过程，避免出现色谱峰度洗提；补充溶剂过程，避免出现色谱峰度洗提；补充溶剂过程，避免出现色谱峰度洗提；补充溶剂过程，避免出现色谱峰气气气气动动动动放放放放大大大大泵泵泵泵2．洗脱方式．洗脱方式 1 1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱））等度洗脱（恒组成溶剂洗脱））等度洗脱（恒组成溶剂洗脱））等度洗脱（恒组成溶剂洗脱） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似类似类似类似GCGC的等温度洗脱的等温度洗脱的等温度洗脱的等温度洗脱2 2）梯度洗提：）梯度洗提：）梯度洗提：）梯度洗提： 流流流流动动动动相相相相中中中中含含含含有有有有两两两两种种种种（（（（或或或或以以以以上上上上））））不不不不同同同同极极极极性性性性的的的的溶溶溶溶剂剂剂剂，，，，在在在在分分分分离离离离过过过过程程程程中中中中按按按按一一一一定定定定的的的的程程程程序序序序连连连连续续续续改改改改变变变变流流流流动动动动相相相相中中中中溶溶溶溶剂剂剂剂的的的的配配配配比比比比和和和和极极极极性性性性，，，，通通通通过过过过流流流流动动动动相相相相中中中中极极极极性性性性的的的的变变变变化化化化来来来来改改改改变变变变被被被被分分分分离离离离组组组组分的容量因子分的容量因子分的容量因子分的容量因子k k和选择性因子，以提高分离效果和选择性因子，以提高分离效果和选择性因子，以提高分离效果和选择性因子，以提高分离效果 适于分析极性差别较大的复杂组分适于分析极性差别较大的复杂组分适于分析极性差别较大的复杂组分适于分析极性差别较大的复杂组分 类似类似类似类似GCGC的程序升温（沸程较长样品）的程序升温（沸程较长样品）的程序升温（沸程较长样品）的程序升温（沸程较长样品） 低低低低压压压压梯梯梯梯度度度度 ：：：：常常常常压压压压下下下下预预预预先先先先按按按按一一一一定定定定的的的的程程程程序序序序将将将将溶溶溶溶剂剂剂剂混混混混合合合合后后后后用泵输入（外梯度）用泵输入（外梯度）用泵输入（外梯度）用泵输入（外梯度）高高高高压压压压梯梯梯梯度度度度 ：：：：将将将将溶溶溶溶剂剂剂剂用用用用高高高高压压压压泵泵泵泵增增增增压压压压后后后后输输输输入入入入色色色色谱谱谱谱系系系系统统统统的的的的梯度混合室，混合后送入色谱柱梯度混合室，混合后送入色谱柱梯度混合室，混合后送入色谱柱梯度混合室，混合后送入色谱柱 （内梯度）（内梯度）（内梯度）（内梯度）3．进样装置．进样装置 要要要要求求求求：：：：将将将将试试试试样样样样“ “浓浓浓浓缩缩缩缩” ”瞬瞬瞬瞬时时时时注注注注入入入入色色色色谱谱谱谱柱柱柱柱上上上上端端端端柱柱柱柱担担担担体体体体的中心成一小点的中心成一小点的中心成一小点的中心成一小点1 1）隔膜进样）隔膜进样）隔膜进样）隔膜进样（高分子有机硅胶垫（高分子有机硅胶垫（高分子有机硅胶垫（高分子有机硅胶垫→→进样室）进样室）进样室）进样室） GC GC系统压力较小，可以系统压力较小，可以系统压力较小，可以系统压力较小，可以 HPLCHPLC系系系系统统统统压压压压力力力力太太太太大大大大，，，，必必必必须须须须停停停停泵泵泵泵进进进进样样样样，，，，t tR R不不不不精精精精确确确确（早期）（早期）（早期）（早期） 2 2）阀进样）阀进样）阀进样）阀进样：不必停泵，六通阀：不必停泵，六通阀：不必停泵，六通阀：不必停泵，六通阀注射器中试样量比定量管中容积大注射器中试样量比定量管中容积大注射器中试样量比定量管中容积大注射器中试样量比定量管中容积大3~53~5倍倍倍倍优点：进样量准确，适用于定量分析；进样量可调优点：进样量准确，适用于定量分析；进样量可调优点：进样量准确，适用于定量分析；进样量可调优点：进样量准确，适用于定量分析；进样量可调4 4．色谱柱：．色谱柱：．色谱柱：．色谱柱：直径直径直径直径4~6mm4~6mm，柱长，柱长，柱长，柱长10~30cm10~30cm 填料粒度填料粒度填料粒度填料粒度5~105~10μmμm柱效评价柱效评价柱效评价柱效评价：色谱系统适应性试验，：色谱系统适应性试验，：色谱系统适应性试验，：色谱系统适应性试验，R R，，，，n n影响因素影响因素影响因素影响因素：填料的性能：填料的性能：填料的性能：填料的性能发发展展展展：减小填料：减小填料：减小填料：减小填料颗颗粒度；减小柱径粒度；减小柱径粒度；减小柱径粒度；减小柱径 填料方法填料方法填料方法填料方法：：：：干法干法干法干法（（（（20 20 μmμm 以上）以上）以上）以上）湿湿湿湿法法法法：：：：匀匀匀匀浆浆浆浆法法法法，，，，以以以以一一一一合合合合适适适适的的的的溶溶溶溶剂剂剂剂或或或或混混混混合合合合溶溶溶溶剂剂剂剂作作作作为为为为分分分分散散散散介介介介质质质质，，，，使使使使填填填填料料料料微微微微粒粒粒粒在在在在介介介介质质质质中中中中高高高高度度度度分分分分散散散散，，，，形形形形成成成成匀匀匀匀浆浆浆浆，，，，高高高高压压压压下下下下将将将将匀匀匀匀浆浆浆浆压压压压入入入入柱柱柱柱管管管管中中中中，，，，制制制制成成成成均均均均匀匀匀匀、、、、紧紧紧紧密密密密的高效柱的高效柱的高效柱的高效柱柱再生柱再生柱再生柱再生：维护、保养、柱子的冲洗：维护、保养、柱子的冲洗：维护、保养、柱子的冲洗：维护、保养、柱子的冲洗4．检测器．检测器 1 1））））紫外光度检测器紫外光度检测器紫外光度检测器紫外光度检测器（最广泛）：（最广泛）：（最广泛）：（最广泛）： 适于吸收紫外光的物质适于吸收紫外光的物质适于吸收紫外光的物质适于吸收紫外光的物质原原原原理理理理：：：：被被被被分分分分析析析析试试试试样样样样组组组组分分分分对对对对特特特特定定定定波波波波长长长长紫紫紫紫外外外外线线线线的的的的选选选选择择择择性性性性吸吸吸吸收，组分浓度与吸光度的关系遵循比尔定律收，组分浓度与吸光度的关系遵循比尔定律收，组分浓度与吸光度的关系遵循比尔定律收，组分浓度与吸光度的关系遵循比尔定律种类种类种类种类：固定波长（单波长和多波长）、可变波长：固定波长（单波长和多波长）、可变波长：固定波长（单波长和多波长）、可变波长：固定波长（单波长和多波长）、可变波长特特特特点点点点: :灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度高高高高，，，，最最最最小小小小检检检检测测测测达达达达1010-9-9g g· ·mLmL-1-1，，，，对对对对温温温温度度度度和和和和流流流流速不敏感，可用于梯度洗提速不敏感，可用于梯度洗提速不敏感，可用于梯度洗提速不敏感，可用于梯度洗提缺点缺点缺点缺点：溶剂受限：溶剂受限：溶剂受限：溶剂受限 荧光检测器荧光检测器：：只能分析自身发光的物质只能分析自身发光的物质只能分析自身发光的物质只能分析自身发光的物质原理原理原理原理：具有对称共轭结构的有机芳环分子受紫外光激发：具有对称共轭结构的有机芳环分子受紫外光激发：具有对称共轭结构的有机芳环分子受紫外光激发：具有对称共轭结构的有机芳环分子受紫外光激发后，能辐射出比紫外光波长较长的荧光；或不发射荧后，能辐射出比紫外光波长较长的荧光；或不发射荧后，能辐射出比紫外光波长较长的荧光；或不发射荧后，能辐射出比紫外光波长较长的荧光；或不发射荧光的物质通过化学衍生转变成能发出荧光的物质光的物质通过化学衍生转变成能发出荧光的物质光的物质通过化学衍生转变成能发出荧光的物质光的物质通过化学衍生转变成能发出荧光的物质3）示差折光检测器：）示差折光检测器： 借借借借 连连连连 续续续续 测测测测 定定定定 流流流流 通通通通 池池池池 中中中中 溶溶溶溶 液液液液 折折折折 射射射射 率率率率 的的的的 差差差差 别别别别 测测测测 定定定定 灵敏度低，温度要求严格灵敏度低，温度要求严格灵敏度低，温度要求严格灵敏度低，温度要求严格 4）电化学检测器）电化学检测器 ：： 根根根根据据据据物物物物质质质质在在在在某某某某些些些些介介介介质质质质中中中中解解解解离离离离后后后后所所所所产产产产生生生生电电电电导导导导变变变变化化化化来来来来测测测测定解离物质含量定解离物质含量定解离物质含量定解离物质含量 5）化学发光）化学发光 6）蒸发光散射检测器）蒸发光散射检测器 不挥发性溶质对光的散射现象不挥发性溶质对光的散射现象不挥发性溶质对光的散射现象不挥发性溶质对光的散射现象§3-3 §3-3 基本理论和条件选择基本理论和条件选择基础基础理论理论n n热力学理论：塔板理论热力学理论：塔板理论n n动力学理论：速率理论动力学理论：速率理论一、塔板理论一、塔板理论1. 1.二、速率理论（与二、速率理论（与GCGC对比）对比）2. 2.，，，，B/uB/u可忽略可忽略可忽略可忽略三、三、 影响分离的因素影响分离的因素1. 1. 固定相与装柱方法的选择固定相与装柱方法的选择固定相与装柱方法的选择固定相与装柱方法的选择：：：： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相选粒径小的、分布均匀的球形固定相选粒径小的、分布均匀的球形固定相选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （（（（dp≤10μmdp≤10μm）））） 首选化学键合相，匀浆法装柱首选化学键合相，匀浆法装柱首选化学键合相，匀浆法装柱首选化学键合相，匀浆法装柱2. 2. 流动相及其流速的选择流动相及其流速的选择流动相及其流速的选择流动相及其流速的选择：：：： 选粘度小、低流速、合适极性的流动相选粘度小、低流速、合适极性的流动相选粘度小、低流速、合适极性的流动相选粘度小、低流速、合适极性的流动相3. 3. 柱温的选择柱温的选择柱温的选择柱温的选择：：：： 选室温选室温选室温选室温25250 0C C左右左右左右左右四、四、HPLCHPLC法中分离条件的选择法中分离条件的选择一、液固吸附色谱法（一、液固吸附色谱法（LSC）） 二、液液分配色谱法（二、液液分配色谱法（LLC）） 三、离子色谱法（三、离子色谱法（IC）） 四、空间排阻色谱法（四、空间排阻色谱法（SEC）） §3-4 各类高效液相色谱法简介各类高效液相色谱法简介1 1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异活性中心能力的差异活性中心能力的差异活性中心能力的差异 （竞争吸附）（竞争吸附）（竞争吸附）（竞争吸附） 分离前提：分离前提：分离前提：分离前提：KK（吸附平衡系数）不等或（吸附平衡系数）不等或（吸附平衡系数）不等或（吸附平衡系数）不等或k k不等不等不等不等一、液固吸附色谱法（一、液固吸附色谱法（LSC）） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂流动相为液体，固定相为固体吸附剂Xm + nSaXa + nSmK=[Xa] [Sm] n[Xm] [Sa] n2 2．固定相：与．固定相：与．固定相：与．固定相：与LCLC比，固定相粒径不同（比，固定相粒径不同（比，固定相粒径不同（比，固定相粒径不同（<10<10μmμm）））） （（（（1 1）硅胶）硅胶）硅胶）硅胶 表孔硅胶（薄壳硅胶）表孔硅胶（薄壳硅胶）表孔硅胶（薄壳硅胶）表孔硅胶（薄壳硅胶） 全多孔硅胶全多孔硅胶全多孔硅胶全多孔硅胶 无定形无定形无定形无定形 5~6 5~6μm μm 球形球形球形球形 3~4 3~4μm μm 堆积硅珠堆积硅珠堆积硅珠堆积硅珠 3~4 3~4 μm μm 硅胶吸水量硅胶吸水量硅胶吸水量硅胶吸水量↑ ↑，，，，LSC→LLCLSC→LLC硅胶含水量较小硅胶含水量较小硅胶含水量较小硅胶含水量较小 吸附色谱吸附色谱吸附色谱吸附色谱 硅胶极性较大硅胶极性较大硅胶极性较大硅胶极性较大硅胶含水量硅胶含水量硅胶含水量硅胶含水量>17% >17% 分配色谱分配色谱分配色谱分配色谱 硅胶失活硅胶失活硅胶失活硅胶失活→→载体载体载体载体 吸附的水吸附的水吸附的水吸附的水→→固定液固定液固定液固定液原理：吸附原理：吸附原理：吸附原理：吸附 特点：峰易拖尾特点：峰易拖尾特点：峰易拖尾特点：峰易拖尾 适用：分离极性化合物适用：分离极性化合物适用：分离极性化合物适用：分离极性化合物（（2）高分子多孔小球：）高分子多孔小球： 原理：吸附原理：吸附原理：吸附原理：吸附+ +分配分配分配分配 兼小孔凝胶作用兼小孔凝胶作用兼小孔凝胶作用兼小孔凝胶作用 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低特点：柱选择性好，峰形好，柱效低特点：柱选择性好，峰形好，柱效低特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物适用：分离弱极性化合物适用：分离弱极性化合物适用：分离弱极性化合物3 3．流动相：各种不同极性的一元或二元溶剂．流动相：各种不同极性的一元或二元溶剂．流动相：各种不同极性的一元或二元溶剂．流动相：各种不同极性的一元或二元溶剂 底剂（烷烃）底剂（烷烃）底剂（烷烃）底剂（烷烃）+ + 有机极性调节剂有机极性调节剂有机极性调节剂有机极性调节剂 üü 例：例：例：例： 正己烷或庚烷正己烷或庚烷正己烷或庚烷正己烷或庚烷 + + 氯仿氯仿氯仿氯仿- - -- - -4 4．出柱顺序：强吸附组分后出柱，弱吸附组分先出柱．出柱顺序：强吸附组分后出柱，弱吸附组分先出柱．出柱顺序：强吸附组分后出柱，弱吸附组分先出柱．出柱顺序：强吸附组分后出柱，弱吸附组分先出柱5 5．影响．影响．影响．影响k k的因素：与固定相性质和流动相性质有关的因素：与固定相性质和流动相性质有关的因素：与固定相性质和流动相性质有关的因素：与固定相性质和流动相性质有关 溶质分子吸附性、极性溶质分子吸附性、极性溶质分子吸附性、极性溶质分子吸附性、极性↑ ↑，洗脱能力，洗脱能力，洗脱能力，洗脱能力↓ ↓，，，，k↑k↑，，，，t tR R↑ ↑ 溶剂系统吸附性、极性溶剂系统吸附性、极性溶剂系统吸附性、极性溶剂系统吸附性、极性↑ ↑，洗脱能力，洗脱能力，洗脱能力，洗脱能力↑ ↑，，，，k↓k↓，，，， t tR R↓ ↓üü注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间1 1．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2 2．．．． 正正正正 相相相相 色色色色 谱谱谱谱 ————固固固固 定定定定 液液液液 极极极极 性性性性 > > 流流流流 动动动动 相相相相 极极极极 性性性性（（（（NLLCNLLC））））ØØ 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱üü 适于分离极性组分适于分离极性组分适于分离极性组分适于分离极性组分 反反反反 相相相相 色色色色 谱谱谱谱 ————固固固固 定定定定 液液液液 极极极极 性性性性 < < 流流流流 动动动动 相相相相 极极极极 性性性性（（（（RLLCRLLC））））ØØ 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱üü 适于分离非极性组分适于分离非极性组分适于分离非极性组分适于分离非极性组分üü3 3．固定相：载体．固定相：载体．固定相：载体．固定相：载体+ +固定液（物理或机械涂渍法）固定液（物理或机械涂渍法）固定液（物理或机械涂渍法）固定液（物理或机械涂渍法）ØØ 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用缺点：系统内部压力大，易流失，不实用缺点：系统内部压力大，易流失，不实用缺点：系统内部压力大，易流失，不实用二、液液分配色谱法（二、液液分配色谱法（LLC））利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面特点：特点：特点：特点： 表面没有液坑，传质快表面没有液坑，传质快表面没有液坑，传质快表面没有液坑，传质快 不易流失，寿命长不易流失，寿命长不易流失，寿命长不易流失，寿命长 热稳定性好热稳定性好热稳定性好热稳定性好 化学性能好化学性能好化学性能好化学性能好 载样量大载样量大载样量大载样量大 可键合不同官能团，选择性灵活可键合不同官能团，选择性灵活可键合不同官能团，选择性灵活可键合不同官能团，选择性灵活 适于梯度洗脱适于梯度洗脱适于梯度洗脱适于梯度洗脱 4、化学键合固定相、化学键合固定相（一）正相键合相色谱（一）正相键合相色谱1 1．分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、．分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、．分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、．分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、 诱导力、或氢键作用力诱导力、或氢键作用力诱导力、或氢键作用力诱导力、或氢键作用力2. 2.固定相：固定相：固定相：固定相：极性大的氰基或氨基键合相极性大的氰基或氨基键合相极性大的氰基或氨基键合相极性大的氰基或氨基键合相3 3．流动相：．流动相：．流动相：．流动相：极性小极性小极性小极性小 底剂底剂底剂底剂 + + 有机极性调节剂有机极性调节剂有机极性调节剂有机极性调节剂 üü 例：正己烷例：正己烷例：正己烷例：正己烷 + + 氯仿氯仿氯仿氯仿- -甲醇，氯仿甲醇，氯仿甲醇，氯仿甲醇，氯仿- -乙醇乙醇乙醇乙醇4．流动相极性与．流动相极性与k的关系：的关系： 流动相极性流动相极性↑，洗脱能力，洗脱能力↑，组分，组分tR↓，，k↓5．出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先．出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先 出柱，极性大的组分后出柱出柱，极性大的组分后出柱6．适用：．适用： 分析极性大物质、糖类等分析极性大物质、糖类等（二）反相键合相色谱（二）反相键合相色谱1 1．固定相：．固定相：．固定相：．固定相：极性小的烷基键合相极性小的烷基键合相极性小的烷基键合相极性小的烷基键合相 C C8 8柱，柱，柱，柱，C C1818柱（柱（柱（柱（ODSODS柱柱柱柱——HPLC——HPLC约约约约80%80%问题）问题）问题）问题）2 2．流动相：．流动相：．流动相：．流动相：极性大的甲醇极性大的甲醇极性大的甲醇极性大的甲醇- -水或乙腈水或乙腈水或乙腈水或乙腈- -水水水水 流动相极性流动相极性流动相极性流动相极性 > > 固定相极性固定相极性固定相极性固定相极性 底剂底剂底剂底剂 + + 有机调节剂（极性调节剂）有机调节剂（极性调节剂）有机调节剂（极性调节剂）有机调节剂（极性调节剂）üü 例：水例：水例：水例：水 + + 甲醇，乙腈，甲醇，乙腈，甲醇，乙腈，甲醇，乙腈，THFTHF3 3．流动相极性与．流动相极性与．流动相极性与．流动相极性与k k的关系：的关系：的关系：的关系： 流动相极性流动相极性流动相极性流动相极性↑ ↑，洗脱能力，洗脱能力，洗脱能力，洗脱能力↓ ↓，，，，k↑k↑，组分，组分，组分，组分t tR R↑ ↑4 4．出柱顺序：极性大的组分先出柱．出柱顺序：极性大的组分先出柱．出柱顺序：极性大的组分先出柱．出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱极性小的组分后出柱极性小的组分后出柱极性小的组分后出柱5 5．适用：非极性．适用：非极性．适用：非极性．适用：非极性~ ~中等极性组分中等极性组分中等极性组分中等极性组分1 1．离子对色谱法（．离子对色谱法（．离子对色谱法（．离子对色谱法（IPCIPC）））） 将将将将一一一一种种种种或或或或多多多多种种种种与与与与溶溶溶溶质质质质分分分分子子子子电电电电荷荷荷荷相相相相反反反反的的的的离离离离子子子子加加加加到到到到流流流流动动动动相相相相或或或或固固固固定定定定相相相相中中中中，，，，使使使使其其其其与与与与溶溶溶溶质质质质离离离离子子子子结结结结合合合合成成成成疏疏疏疏水水水水型型型型离子对化合物，在两相间分配离子对化合物，在两相间分配离子对化合物，在两相间分配离子对化合物，在两相间分配三、离子色谱法（三、离子色谱法（IC））KXY=[X+Y-]有机相有机相[X+]水相水相 [ Y-]水相水相溶质的分配系数为溶质的分配系数为DX=[X+Y-]有机相有机相[X+]水相水相=KXY [ Y-]水相水相1 1）离子对试剂：）离子对试剂：）离子对试剂：）离子对试剂： 烷基磺酸类烷基磺酸类烷基磺酸类烷基磺酸类 → →分析碱分析碱分析碱分析碱 阳离子阳离子阳离子阳离子 烷基磺酸钠烷基磺酸钠烷基磺酸钠烷基磺酸钠 烷基铵类烷基铵类烷基铵类烷基铵类 → →分析酸分析酸分析酸分析酸 阴离子阴离子阴离子阴离子 四丁基季胺盐四丁基季胺盐四丁基季胺盐四丁基季胺盐2 2）按流动相和固定相行性质分）按流动相和固定相行性质分）按流动相和固定相行性质分）按流动相和固定相行性质分 正相离子对色谱法正相离子对色谱法正相离子对色谱法正相离子对色谱法 反相离子对色谱法反相离子对色谱法反相离子对色谱法反相离子对色谱法3 3）适用：较强的有机酸、碱）适用：较强的有机酸、碱）适用：较强的有机酸、碱）适用：较强的有机酸、碱2．反相离子抑制色谱．反相离子抑制色谱 在在在在反反反反相相相相离离离离子子子子色色色色谱谱谱谱中中中中，，，，通通通通过过过过加加加加入入入入缓缓缓缓冲冲冲冲溶溶溶溶液液液液调调调调节节节节流流流流动动动动相相相相pHpH值值值值，，，，抑抑抑抑制制制制组组组组分分分分解解解解离离离离，，，，增增增增加加加加其其其其k k和和和和t tR R，，，，以以以以达达达达到到到到改改改改善善善善分离的目的分离的目的分离的目的分离的目的1 1）离子抑制剂：）离子抑制剂：）离子抑制剂：）离子抑制剂： 弱酸、弱碱性物质弱酸、弱碱性物质弱酸、弱碱性物质弱酸、弱碱性物质 pH pH一定的缓冲溶液一定的缓冲溶液一定的缓冲溶液一定的缓冲溶液2 2））））k k的影响因素：的影响因素：的影响因素：的影响因素：üü选择流动相：应同时考虑极性及选择流动相：应同时考虑极性及选择流动相：应同时考虑极性及选择流动相：应同时考虑极性及pHpH值值值值 酸性物质酸性物质酸性物质酸性物质————加入酸加入酸加入酸加入酸HAc tHAc tR R↑ ↑，，，，k↑ k↑ 碱性物质碱性物质碱性物质碱性物质————加入碱加入碱加入碱加入碱NHNH3 3·H·H2 2O tO tR R↑ ↑，，，，k↑ k↑ üü调节调节调节调节pHpH范围：范围：范围：范围： pH>8.0 pH>8.0 破坏键合相与载体的结合破坏键合相与载体的结合破坏键合相与载体的结合破坏键合相与载体的结合 pH<3.0 pH<3.0 腐蚀柱子腐蚀柱子腐蚀柱子腐蚀柱子3 3）适用：极弱酸碱物质）适用：极弱酸碱物质）适用：极弱酸碱物质）适用：极弱酸碱物质 pH=3~7pH=3~7弱酸；弱酸；弱酸；弱酸；pH=7~8pH=7~8弱碱；两性化合物弱碱；两性化合物弱碱；两性化合物弱碱；两性化合物3 3．离子交换色谱法（．离子交换色谱法（IECIEC）） 离离离离子子子子交交交交换换换换树树树树脂脂脂脂上上上上可可可可解解解解离离离离的的的的离离离离子子子子与与与与流流流流动动动动相相相相中中中中具具具具有有有有相相相相同同同同电电电电荷荷荷荷的的的的溶溶溶溶质质质质离离离离子子子子进进进进行行行行可可可可逆逆逆逆交交交交换换换换，，，，根根根根据据据据离离离离子子子子对对对对交交交交换换换换剂剂剂剂的的的的亲亲亲亲和和和和力力力力不不不不同同同同而而而而分分分分离离离离。

凡凡凡凡是是是是在在在在溶溶溶溶剂剂剂剂中中中中能能能能够解离的物质通常都可用离子交换色谱法进行够解离的物质通常都可用离子交换色谱法进行够解离的物质通常都可用离子交换色谱法进行够解离的物质通常都可用离子交换色谱法进行 被被被被分分分分析析析析物物物物质质质质解解解解离离离离后后后后产产产产生生生生的的的的离离离离子子子子与与与与树树树树脂脂脂脂上上上上带带带带有有有有相相相相同同同同电电电电荷荷荷荷的离子进行交换，达到平衡的离子进行交换，达到平衡的离子进行交换，达到平衡的离子进行交换，达到平衡阳离子交换阳离子交换阴离子交换阴离子交换溶剂中溶剂中溶剂中溶剂中溶剂中溶剂中溶剂中溶剂中阴离子交换的平衡常数为阴离子交换的平衡常数为KX=[-NR4+X-][Cl-][-NR4+Cl-][X-]分配系数分配系数为为DX=[-NR4+X-][X-]=KX[-NR4+Cl-][Cl-]分配系数分配系数D越大，溶质的离子与离子交换剂的作用越大，溶质的离子与离子交换剂的作用越强，保留值越大越强，保留值越大固定相固定相固定相固定相 薄膜型离子交换树脂（薄壳型）薄膜型离子交换树脂（薄壳型）薄膜型离子交换树脂（薄壳型）薄膜型离子交换树脂（薄壳型） 离子交换键合固定相：用化学反应将离子交换基团离子交换键合固定相：用化学反应将离子交换基团离子交换键合固定相：用化学反应将离子交换基团离子交换键合固定相：用化学反应将离子交换基团 键合在惰性担体表面键合在惰性担体表面键合在惰性担体表面键合在惰性担体表面 阳离子交换树脂（强酸、弱酸型）阳离子交换树脂（强酸、弱酸型）阳离子交换树脂（强酸、弱酸型）阳离子交换树脂（强酸、弱酸型） 阴离子交换树脂（强碱、弱碱型）阴离子交换树脂（强碱、弱碱型）阴离子交换树脂（强碱、弱碱型）阴离子交换树脂（强碱、弱碱型）4 4．离子色谱法．离子色谱法．离子色谱法．离子色谱法 在在在在离离离离子子子子交交交交换换换换色色色色谱谱谱谱法法法法基基基基础础础础上上上上发发发发展展展展，，，，常常常常用用用用于于于于水水水水溶溶溶溶液液液液中阴离子的分析中阴离子的分析中阴离子的分析中阴离子的分析1 1）固定相）固定相）固定相）固定相: : 离子交换树脂离子交换树脂离子交换树脂离子交换树脂2 2）流动相：）流动相：）流动相：）流动相： 电解质溶液电解质溶液电解质溶液电解质溶液3 3）检测器：）检测器：）检测器：）检测器： 常用电导检测器常用电导检测器常用电导检测器常用电导检测器4 4）化学抑制型离子色谱）化学抑制型离子色谱）化学抑制型离子色谱）化学抑制型离子色谱 高电导洗脱液（如高电导洗脱液（如高电导洗脱液（如高电导洗脱液（如NaOHNaOH）））） 非抑制型离子色谱非抑制型离子色谱非抑制型离子色谱非抑制型离子色谱 低电导洗脱液（苯甲酸盐等）低电导洗脱液（苯甲酸盐等）低电导洗脱液（苯甲酸盐等）低电导洗脱液（苯甲酸盐等）化学抑制型离子色谱化学抑制型离子色谱由于洗脱液中由于洗脱液中OH-浓度大，且电导值较高，待测离浓度大，且电导值较高，待测离子浓度变化引起的电导变化小，采用子浓度变化引起的电导变化小，采用抑制柱抑制柱交换交换洗脱洗脱阴离子阴离子Br-为例为例NaOH转换成水，本底影响消除，转换成水，本底影响消除，Br-成相应的酸，成相应的酸，H+的离子淌度是的离子淌度是Na+的的7倍，电导变化明显倍，电导变化明显四四四四 、空间排阻色谱法、空间排阻色谱法、空间排阻色谱法、空间排阻色谱法根据分子大小进行分离根据分子大小进行分离根据分子大小进行分离根据分子大小进行分离1 1））））分离机理分离机理分离机理分离机理：类似于分子筛：类似于分子筛：类似于分子筛：类似于分子筛 固定相固定相固定相固定相 ：：：： 凝胶；具有一定大小的孔穴凝胶；具有一定大小的孔穴凝胶；具有一定大小的孔穴凝胶；具有一定大小的孔穴 大大大大分分分分子子子子不不不不能能能能进进进进入入入入孔孔孔孔穴穴穴穴，，，，受受受受到到到到排排排排阻阻阻阻，，，，直直直直接接接接通通通通过过过过柱柱柱柱子子子子，，，，先先先先被洗脱；被洗脱；被洗脱；被洗脱； 很很很很小小小小的的的的分分分分子子子子渗渗渗渗透透透透在在在在所所所所有有有有胶胶胶胶孔孔孔孔中中中中，，，，后后后后被被被被洗洗洗洗脱脱脱脱，，，，保保保保留留留留值值值值最最最最大；大；大；大； 中等大小的分子可渗透某些孔穴，以中等速度通过中等大小的分子可渗透某些孔穴，以中等速度通过中等大小的分子可渗透某些孔穴，以中等速度通过中等大小的分子可渗透某些孔穴，以中等速度通过 溶剂分子通常最小，最后洗脱，溶剂分子通常最小，最后洗脱，溶剂分子通常最小，最后洗脱，溶剂分子通常最小，最后洗脱，t tMM最大最大最大最大 2 2）凝胶的）凝胶的）凝胶的）凝胶的排斥极限（排斥极限（排斥极限（排斥极限（A A点）点）点）点） 凡凡凡凡是是是是比比比比A A点点点点对对对对应应应应的的的的MM大大大大的的的的分分分分子子子子，，，，均均均均被被被被排排排排斥斥斥斥于于于于所所所所有有有有的的的的胶胶胶胶孔孔孔孔之之之之外外外外，，，，在在在在保保保保留留留留体体体体积积积积为为为为V V0 0时时时时，，，，以以以以单单单单峰峰峰峰形形形形式式式式被被被被洗脱洗脱洗脱洗脱（（（（V V0 0是凝胶填料颗粒之间的体积）是凝胶填料颗粒之间的体积）是凝胶填料颗粒之间的体积）是凝胶填料颗粒之间的体积）3 3）凝胶的）凝胶的）凝胶的）凝胶的渗透极限（渗透极限（渗透极限（渗透极限（B B点）点）点）点） 凡凡凡凡是是是是比比比比B B点点点点相相相相应应应应的的的的MM小小小小是是是是分分分分子子子子都都都都可可可可完完完完全全全全渗渗渗渗入入入入凝凝凝凝胶胶胶胶孔孔孔孔穴穴穴穴中中中中，，，，在在在在保保保保留留留留体积为体积为体积为体积为V VMM时，一次洗脱，单峰时，一次洗脱，单峰时，一次洗脱，单峰时，一次洗脱，单峰 MMB B

体系中的痕量组分体系中的痕量组分体系中的痕量组分 正相色谱分离有机溶剂中的物质正相色谱分离有机溶剂中的物质正相色谱分离有机溶剂中的物质正相色谱分离有机溶剂中的物质 反相色谱分离水溶液中的物质反相色谱分离水溶液中的物质反相色谱分离水溶液中的物质反相色谱分离水溶液中的物质--------生化物质生化物质生化物质生化物质2 2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对 色色色色谱谱谱谱法法法法分分分分析析析析离离离离子子子子型型型型体体体体的的的的含含含含量量量量蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质、、、、氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸、、、、常常常常见阴阳离子等）见阴阳离子等）见阴阳离子等）见阴阳离子等）3 3、、、、利利利利用用用用多多多多孔孔孔孔凝凝凝凝胶胶胶胶固固固固定定定定相相相相建建建建立立立立空空空空间间间间排排排排阻阻阻阻色色色色谱谱谱谱法法法法可可可可分分分分离离离离高高高高分分分分子化合物子化合物。

子化合物子化合物4 4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化合物利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化合物利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化合物利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化合物作业：作业：P109 1，，4，，6，，7，，8。