第一章组织培养基本原理和设施.ppt

               第一章 基本原理和设施基本原理和设施 一、植物组织培养的基本原理一、植物组织培养的基本原理 n n1. 1.植物细胞全能性植物细胞全能性 植物细胞的全能性植物细胞的全能性植物细胞的全能性植物细胞的全能性：：植物细胞的全能性是指植物体植物细胞的全能性是指植物体的每个具有完整细胞核的细胞，都具有该植物的全部遗的每个具有完整细胞核的细胞，都具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的潜在能力传信息和发育成完整植株的潜在能力 原理原理原理原理：：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞活细胞都应该具有全都应该具有全能性能性 两个含义：两个含义：1 1）植物细胞无论是体细胞还是生殖细胞，均具有该物种）植物细胞无论是体细胞还是生殖细胞，均具有该物种全部的遗传信息全部的遗传信息. .2 2）每个植物细胞均具有发育成完整植物体的潜在能力）每个植物细胞均具有发育成完整植物体的潜在能力. .  差异：差异：差异：差异：（（1 1）） 受精卵的全能性受精卵的全能性最高最高 （（2 2）） 受精卵分受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低低。

潜在全能性的原因：潜在全能性的原因：潜在全能性的原因：潜在全能性的原因：基因表达的选择性基因表达的选择性 科学研究表明，科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养 2 2、植物细胞的分化、植物细胞的分化 植物细胞分化植物细胞分化植物细胞分化植物细胞分化是指导致细胞形成不同结构，引起功是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程能改变或潜在发育方式改变的过程 植物细胞分化是多细胞生物体形态发生的基础植物细胞分化是多细胞生物体形态发生的基础 植植物个体的发育是植物细胞不断分裂、生长和分化的结果物个体的发育是植物细胞不断分裂、生长和分化的结果在整个植物生长发育过程中，由于顶端分生组织活跃分裂在整个植物生长发育过程中，由于顶端分生组织活跃分裂的结果，通过一系列复杂的形态发生过程，形成不同的器的结果，通过一系列复杂的形态发生过程，形成不同的器官和组织，即在植物体内分化出了各种不同类型的细胞群。

官和组织，即在植物体内分化出了各种不同类型的细胞群从而使植物体的成熟部分具有了复杂的内部结构，最后开从而使植物体的成熟部分具有了复杂的内部结构，最后开花结实完成其生活史花结实完成其生活史 细胞分化在植物形态建成中是一个核心问题，没有细胞细胞分化在植物形态建成中是一个核心问题，没有细胞的分化就没有形态建成的分化就没有形态建成 细胞分裂、生长、分化是生物体发生的三个基本现象细胞分裂、生长、分化是生物体发生的三个基本现象 细胞分化的结果：细胞分化的结果：细胞分化的结果：细胞分化的结果：导致形态发生，从而形成不同器官，不同导致形态发生，从而形成不同器官，不同器官又执行着不同功能器官又执行着不同功能 植物的每个生活细胞具有全能性，但任何一个细胞在其整植物的每个生活细胞具有全能性，但任何一个细胞在其整个生活周期中，只能表达其基因库中的极小部分内容，而各个生活周期中，只能表达其基因库中的极小部分内容，而各个细胞在不同的时间、空间和内外条件下，表达的内容是不个细胞在不同的时间、空间和内外条件下，表达的内容是不同的，因而就出现了机能和形态的差异。

所以，分化也可说同的，因而就出现了机能和形态的差异所以，分化也可说是一个基因型的细胞所具有的不同的表现型是一个基因型的细胞所具有的不同的表现型 细胞的结构和功能的不同或发育方式的不同，从而产生分细胞的结构和功能的不同或发育方式的不同，从而产生分工的不同工的不同 在系统发育上，植物越进化，细胞分工越细致，细胞的在系统发育上，植物越进化，细胞分工越细致，细胞的分化就越剧烈，植物体的内部结构也就越复杂分化就越剧烈，植物体的内部结构也就越复杂 n n 细胞分化是一个复杂的问题，同一植物的所有细胞均细胞分化是一个复杂的问题，同一植物的所有细胞均来自于受精卵，它们具有相同的遗传物质，但它们却可以来自于受精卵，它们具有相同的遗传物质，但它们却可以分化成不同的形态；即使同一个细胞，在不同的内外条件分化成不同的形态；即使同一个细胞，在不同的内外条件下也可能分化成不同的类型细胞的极性、细胞在植物体下也可能分化成不同的类型细胞的极性、细胞在植物体中的位置、细胞的发育时期、各种激素和某些化学物质，中的位置、细胞的发育时期、各种激素和某些化学物质，以及光照、温度、湿度等物理因素都能影响分化。

以及光照、温度、湿度等物理因素都能影响分化 所以我们可以通过人为的控制，使得分化的结果能够所以我们可以通过人为的控制，使得分化的结果能够满足人们的需要满足人们的需要 在分化的控制上，激素的调节作用是十分重要的在分化的控制上，激素的调节作用是十分重要的但调控因子是十分复杂的，另外像外界环境因子但调控因子是十分复杂的，另外像外界环境因子( (光、温光、温度等度等) )及细胞和组织内本身的启动和操纵，都能影响到细及细胞和组织内本身的启动和操纵，都能影响到细胞分化3.3.3.3.植物激素在形态建成中的作用植物激素在形态建成中的作用植物激素在形态建成中的作用植物激素在形态建成中的作用 植物激素是植物激素是植物激素是植物激素是指自然状态下植物体内合成，并从产生处指自然状态下植物体内合成，并从产生处运送到别处，对生长发育产生显著作用的微量有机物运送到别处，对生长发育产生显著作用的微量有机物 植物激素是培养基的关键物质，对植物组织培养起着十植物激素是培养基的关键物质，对植物组织培养起着十植物激素是培养基的关键物质，对植物组织培养起着十植物激素是培养基的关键物质，对植物组织培养起着十分重要和明显的调控作用，植物激素包括内源激素生长素、分重要和明显的调控作用，植物激素包括内源激素生长素、分重要和明显的调控作用，植物激素包括内源激素生长素、分重要和明显的调控作用，植物激素包括内源激素生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯及人工合成的植物生细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯及人工合成的植物生细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯及人工合成的植物生细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯及人工合成的植物生长调节剂。

长调节剂长调节剂长调节剂 植物生长植物生长调节物质调节物质植物激素植物激素植物生长调节剂植物生长调节剂在植物组织培养中使用的生长调节物质主要有生长素类和细胞分裂素类两大类，少数培养基中还添加赤霉素GA3等（（1）种类　）种类　IAA　　NAA　　IBA　　2,4－－D （（2）作用：）作用： 　　诱导愈伤组织形成，体细胞胚的产生，以及诱导根的分诱导愈伤组织形成，体细胞胚的产生，以及诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长化和促进细胞分裂、伸长生长 生长素配合一定比例的细胞分裂素对于器官的形成和植株生长素配合一定比例的细胞分裂素对于器官的形成和植株再生可以起到调控作用，它们的比例决定着发育的细胞类型，再生可以起到调控作用，它们的比例决定着发育的细胞类型，决定着愈伤组织再分化，是长根还是长芽决定着愈伤组织再分化，是长根还是长芽 生长素生长素/ /细胞分裂素的比值高，有利于根的形成和愈伤组织的细胞分裂素的比值高，有利于根的形成和愈伤组织的形成；比值适中时，有利于根芽的分化；比值低时，有利于形成；比值适中时，有利于根芽的分化；比值低时，有利于芽的形成。

芽的形成 根对生长素最敏感，在极低浓度下就可促进生长，其次是根对生长素最敏感，在极低浓度下就可促进生长，其次是茎和芽 1 1、生长素、生长素 (auxin) (auxin)n nIAA(IAA(吲吲吲吲哚哚哚哚乙乙乙乙酸酸酸酸) ) 是是天天然然存存在在的的生生长长素素，，亦亦可可人人工工合合成成，，其其活活力力较较低低，，是是生生长长素素中中活活力力最最弱弱的的激激素素，，对对器器官官形形成成的的 副副作作用用小小，，高高温温高高压压易易被被破破坏坏，，也易被细胞中的也易被细胞中的IAAIAA分解酶降解，受光也易分解分解酶降解，受光也易分解n nNAA(NAA(萘乙酸萘乙酸萘乙酸萘乙酸) ) 在组织培养中的起动能力要比在组织培养中的起动能力要比IAAIAA高出高出3-43-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍NAANAA和和IBAIBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长芽的增殖和生长 n nIBA(IBA(吲哚丁酸吲哚丁酸吲哚丁酸吲哚丁酸) )   是促进发根能力较强的生长调节物质。

是促进发根能力较强的生长调节物质n n2 2，，，，4-D(24-D(2，，，，4-4-二二二二氯氯氯氯苯苯苯苯氧氧氧氧乙乙乙乙酸酸酸酸) )      起起动动能能力力比比IAAIAA高高1010倍倍，，特特别别在在促促进进愈愈伤伤组组织织的的形形成成上上活活力力最最高高，，但但它它强强烈烈抑抑制制芽芽的的形形成成，，影影响响器器官官的的发发育育适适宜宜的的用用量量范范围围较较狭狭窄，过量常有毒效应窄，过量常有毒效应n n生长素配制可先用少量生长素配制可先用少量9595％酒精助溶％酒精助溶n n2 2，，4-D4-D可可用用0.1mol0.1mol／／L L的的NaOHNaOH或或KOHKOH助助溶溶生生长长素素常常配配成成1mg/ml1mg/ml的溶液贮于冰箱中备用的溶液贮于冰箱中备用•注意：注意：天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏在植物体内也易受到体内酶的分解条件易被破坏在植物体内也易受到体内酶的分解组织培养中常用人工合成的生长素类物质组织培养中常用人工合成的生长素类物质2 2 细胞分裂素类细胞分裂素类细胞分裂素类细胞分裂素类                                    这这类类激激素素是是腺腺嘌嘌呤呤的的衍衍生生物物，，细细胞胞分分裂裂素素有有激激动动素素(KT)(KT)、、6-6-苄苄基基氨氨基基嘌嘌呤呤(6-BA)(6-BA)、、玉玉米米素素(ZT)(ZT)、、2 2异异戊戊烯烯腺腺嘌嘌呤呤（（2ip2ip））和和6-6-苄苄基基腺腺嘌嘌呤呤（（BAPBAP））等等。

其其中中ZTZT活性最强，但非常昂贵，常用的是活性最强，但非常昂贵，常用的是6-BA6-BA在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：n n①①诱诱导导愈愈伤伤组组织织、、不不定定芽芽和和不不定定胚胚的的产产生生 细细胞胞分分裂裂素素与与生生长长素素相相互互作作用用，，当当组组织织内内细细胞胞分分裂裂素素／／生生长长素素的的比比值值高高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽n n②②促促进进细细胞胞分分裂裂与与扩扩大大促促进进细细胞胞分分裂裂与与器器官官分分化化、、延延缓缓组组织织衰衰老老，，增增强强蛋蛋白白质质合合成成诱诱导导不不定定芽芽的的分分化化、、茎茎、、苗苗的的增殖n n③③抑制根的分化抑制根的分化避免在生根培养时使用避免在生根培养时使用n n3 GA(3 GA(赤霉素赤霉素赤霉素赤霉素) )       n n种种种种类类类类：：：：种种类类多多，，生生理理活活性性及及作作用用的的种种类类、、部部位位、、效效应应等等各有不同各有不同培养基中添加的是培养基中添加的是培养基中添加的是培养基中添加的是GA3GA3。

n n作作作作用用用用：：：：主主要要用用于于促促茎茎伸伸长长，，促促胚胚发发育育成成植植株株；；打打破破休休眠眠赤赤霉霉素素和和生生长长素素协协同同作作用用，，对对形形成成层层的的分分化化有有影影响响，，当当生生长长素素／／赤赤霉霉素素比比值值高高时时有有利利于于木木质质部部分分化化，，比比值值低低时时有有利利于于韧韧皮皮部部分分化化赤赤霉霉素素还还用用于于打打破破休休眠眠，，促促进进种种子子、、块茎、鳞茎提前萌发等块茎、鳞茎提前萌发等 n n特特特特性性性性：：：：赤赤霉霉素素溶溶于于酒酒精精，，配配制制时时可可用用少少量量9595％％酒酒精精助助溶溶赤赤霉霉素素不不耐耐热热，，高高压压灭灭菌菌后后将将有有7070％％-100-100％％失失效效，，应应当当采用过滤灭菌法加入采用过滤灭菌法加入n n 脱落酸（脱落酸（ABAABA）在组织培养中很少使用有些例子）在组织培养中很少使用有些例子表明，加在培养基中的脱落酸，或是能促进愈伤组织表明，加在培养基中的脱落酸，或是能促进愈伤组织的生长，或是能抑制它的生长，其作用因物种而不同，的生长，或是能抑制它的生长，其作用因物种而不同，在胚培养中，脱落酸能抑制胚的早熟萌发，促进晚期在胚培养中，脱落酸能抑制胚的早熟萌发，促进晚期胚胎的正常成熟。

另外，在植物种质资源超低温冷冻胚胎的正常成熟另外，在植物种质资源超低温冷冻保存时，可以用来促使植物停止生长和抗寒力的形成，保存时，可以用来促使植物停止生长和抗寒力的形成，从而保证冷冻保存的顺利进行从而保证冷冻保存的顺利进行n n 乙烯对组织培养物芽的诱导和形成有促进或抑制作乙烯对组织培养物芽的诱导和形成有促进或抑制作用，这与植物种类及处理时间有关如乙烯和二氧化用，这与植物种类及处理时间有关如乙烯和二氧化碳的相互作用对针叶树芽的诱导有较大影响碳的相互作用对针叶树芽的诱导有较大影响 二、植物组织培养的常用设施、设备及培养环二、植物组织培养的常用设施、设备及培养环二、植物组织培养的常用设施、设备及培养环二、植物组织培养的常用设施、设备及培养环境境境境 在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。

地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室 实验室的大小取决于工作的目的和规模：实验室的大小取决于工作的目的和规模：实验室的大小取决于工作的目的和规模：实验室的大小取决于工作的目的和规模： 1. 1. 1. 1. 以以以以工工工工厂厂厂厂化化化化生生生生产产产产为为为为目目目目的的的的，，，，实实实实验验验验室室室室规规规规模模模模太太太太小小小小，，，，则则则则会会会会限限限限制制制制生产影响效率生产影响效率生产影响效率生产影响效率 2. 2. 2. 2. 在在在在设设设设计计计计组组组组织织织织培培培培养养养养实实实实验验验验室室室室时时时时，，，，应应应应按按按按组组组组织织织织培培培培养养养养程程程程序序序序来来来来设设设设计计计计, , , ,避免某些环节倒排，引起日后工作混乱避免某些环节倒排，引起日后工作混乱避免某些环节倒排，引起日后工作混乱避免某些环节倒排，引起日后工作混乱 植植植植物物物物组组组组织织织织培培培培养养养养是是是是在在在在严严严严格格格格无无无无菌菌菌菌的的的的条条条条件件件件下下下下进进进进行行行行的的的的。

要要要要做做做做到到到到无无无无菌菌菌菌的的的的条条条条件件件件，，，，需需需需要要要要一一一一定定定定的的的的设设设设备备备备、、、、器器器器材材材材和和和和用用用用具具具具，，，，同同同同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件 组培的组培的技术路线技术路线：：外植体外植体→→愈伤组织愈伤组织→→不定芽不定芽→→生根生根→→再生植株再生植株基本的基本的工艺流程工艺流程：： 容器具洗涤，物质准备容器具洗涤，物质准备→→配置培养基并灭菌配置培养基并灭菌→→外植体消毒与无菌操作接种外植体消毒与无菌操作接种→→观察、记录、观察、记录、处理（脱分化、再分化、继代）处理（脱分化、再分化、继代） → →再生植株再生植株实验室设计原则：实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止保证无菌操作，达到工作方便，防止污染实验室组成：实验室组成： 准备室、无菌操作室、培养室、温室准备室、无菌操作室、培养室、温室  （一）基本设施1 1、、准备室准备室准备室准备室 在准备室主要进行一些常规的实验操作，如在准备室主要进行一些常规的实验操作，如植物组织培养中所需器皿和其它仪器的清洗、干植物组织培养中所需器皿和其它仪器的清洗、干燥和保存，培养基的制备和灭菌，常规的生理生燥和保存，培养基的制备和灭菌，常规的生理生化分析等。

植物组织培养中常用的化学试剂、玻化分析等植物组织培养中常用的化学试剂、玻璃器皿也存放在这里璃器皿也存放在这里 如果房间较多，可将准备室分为洗涤室和如果房间较多，可将准备室分为洗涤室和培养基配制室两部分洗涤室专门负责试管苗出培养基配制室两部分洗涤室专门负责试管苗出瓶与培养器皿的清洗工作；培养基配制室则负责瓶与培养器皿的清洗工作；培养基配制室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作  准备室里通常摆放着植物组织培养中常用的仪器设准备室里通常摆放着植物组织培养中常用的仪器设备，包括普通天平和分析天平、低温冰箱（若无低温冰备，包括普通天平和分析天平、低温冰箱（若无低温冰箱，普通冰箱也可）、水浴锅、磁力搅拌器、高压灭菌箱，普通冰箱也可）、水浴锅、磁力搅拌器、高压灭菌锅、烘箱、酸度计、恒温培养箱、微波炉和电磁炉，还锅、烘箱、酸度计、恒温培养箱、微波炉和电磁炉，还应配备放置药品和玻璃仪器的橱柜在没有细胞学实验应配备放置药品和玻璃仪器的橱柜在没有细胞学实验室作为配套实验室的情况下，植物石蜡切片和组织染色室作为配套实验室的情况下，植物石蜡切片和组织染色的设备也放在这里，如石蜡切片机、恒温箱、烘片箱和的设备也放在这里，如石蜡切片机、恒温箱、烘片箱和染色缸等。

显微镜、体视显微镜等可以放在无菌操作室染色缸等显微镜、体视显微镜等可以放在无菌操作室内，这样才满足对培养材料生长情况记录的要求内，这样才满足对培养材料生长情况记录的要求 可见，准备室要有足够的空间和一个较大的工作台，可见，准备室要有足够的空间和一个较大的工作台，以满足植物组织培养中培养基的制备、材料处理和实验以满足植物组织培养中培养基的制备、材料处理和实验观察研究等工作植物组织培养研究离不开拍照，还需观察研究等工作植物组织培养研究离不开拍照，还需配备光学相机或数码相机配备光学相机或数码相机n n2. 无菌操作室 植物组织培养的无菌操作是进行植物材料的植物组织培养的无菌操作是进行植物材料的消毒、分离接种以及培养物的继代转移操作的消毒、分离接种以及培养物的继代转移操作的场所 超净工作台是无菌操作室的主要设备超净超净工作台是无菌操作室的主要设备超净台的优点是操作方便自如，比较舒适，工作效台的优点是操作方便自如，比较舒适，工作效率高，准备时间短率高，准备时间短 n n陈列于操作室（接种室）中n类型：垂直式和水平式n作用：无菌操作用n n3 3、培养室、培养室、培养室、培养室：：是接种的材料培养生长的场所。

是接种的材料培养生长的场所 其设计以充分利用空间和节省能源为原则其设计以充分利用空间和节省能源为原则 主要设备：主要设备：培养架（控温控光控湿）培养架（控温控光控湿）、空调、、空调、摇床、培养箱、紫外光源等摇床、培养箱、紫外光源等 培养条件：培养条件：T T＝＝2525℃℃±2 ±2 ；；L L＝＝10001000－－6000Lx6000Lx；； t t＝＝10-16 h/d 10-16 h/d ；；7070％％

同时，料，从而使初代污染得到有效控制同时，温室也为试管苗的移栽提供良好的炼苗场所，温室也为试管苗的移栽提供良好的炼苗场所，温室内应配置有温度控制装置、通风口、喷温室内应配置有温度控制装置、通风口、喷雾装置、光照调节装置、杀菌杀虫工具及相雾装置、光照调节装置、杀菌杀虫工具及相应药剂等应药剂等n n（二）主要仪器和设备（二）主要仪器和设备 1 1、常用设备、常用设备（（1 1）） 无菌操作设备无菌操作设备 包括超净工作台、高压蒸汽灭菌和烘箱等包括超净工作台、高压蒸汽灭菌和烘箱等 灭菌锅灭菌锅n n陈列于灭菌室中n类型：普通医用消毒锅n n　　　大的高压灭菌锅n作用：培养基、水和各种器皿的消毒仪仪 器器 设设 备备高压灭菌锅高压灭菌锅手提式灭菌锅手提式灭菌锅 烘箱n n陈列于洗涤室n n作用：干燥洗后的器皿　　　 高温干热灭菌　　　 测定培养物的干重　　　烘烘烘烘 箱箱箱箱（2）培养设备 培养设备是为培养物创造适宜的光、温、水、气等条件的设备.n n ① 空调n n② 加湿器或去湿机n n③ 定时器 n n④ 培养架。

n n⑤ 摇床或旋转床n n⑥ 恒温恒湿光照培养箱（3）药品贮存和配制仪器设备 n n① 冰箱n n② 天平n n ③ 酸度计 n n④ 微波炉或电磁——用以融化琼脂 冰冰 箱箱n n陈列于制备室中n作用：低温保存材料，存放药品、培养基母液、激素、酶制剂 天天 平平n n陈列于制备室中n作用：称取大量元素、微量元素、 酶制剂酸度计酸度计n n陈列于制备室中n作用：测定培养基及酶制剂的ｐＨ值PHS-802中文台式酸度计通用型或经济型酸度计 （4）观察分析仪器设备n n陈列于观察室中n类型：n n 体视显微镜 用以植物组织形态分化的实 体观察，不定芽、不定胚的早期识别，植物茎尖的切取 n n 倒置显微镜 原生质体观察n n 普通显微镜 染色体和叶片气孔观察n n 荧光显微镜 细胞活力观察n n 解剖显微镜 立体观察需配备光学相机或数码相机 n n（（5 5）其他仪器设备）其他仪器设备 ①① 离心机。

进行原生质体分离时，需要离心机进行原生质体分离时，需要离心机②② 蒸馏水制备装置需要时，还可进行重蒸馏水制备装置需要时，还可进行重蒸馏水来获得纯度更高的蒸馏水蒸馏水来获得纯度更高的蒸馏水 除此之外，电炉、水浴锅、药品柜和晾除此之外，电炉、水浴锅、药品柜和晾干架等也是植物组织培养中所需要的干架等也是植物组织培养中所需要的 . .n n2. 主要器皿（1）培养器皿 培培养养用用的的玻玻璃璃器器皿皿要要求求透透光光度度好好，，能能耐耐高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌根根据据培培养养目目的的和和要要求求不不同同，，可可采采用不同种类和规格的玻璃器皿用不同种类和规格的玻璃器皿 一一般般用用：：试试管管 、、三三角角瓶瓶（（锥锥形形瓶瓶））、、果果酱酱瓶瓶或或罐罐头头瓶瓶、、培培养养皿皿 、、植植物物组组织织培培养养专专用用容容器器…………n n 瓶口封塞可用多种方法，要具有一定的通气性和密闭性，以防止培养基干燥和杂菌污染n n 以前封口常用棉塞不过这种封口办法夏季极易污染，且不易保持培养基湿度。

现在多采用聚丙烯塑料膜作为封口，以线绳结扎或橡皮圈箍扎也可采用专用的封口材料如封口膜n n（2） 分注器 使用分注器的目的是将培养基定量地注入到培养皿中分注器有注射器分注器、漏斗式分注器、量筒式分注器等类型n n（3） 离心管 离心管用于离心，将培养的细胞或制备的原离心管用于离心，将培养的细胞或制备的原生质体从培养基中分离出来，并进行收集生质体从培养基中分离出来，并进行收集n n（4） 其他玻璃器皿 主要是量筒、量杯、烧杯、吸管、滴管、主要是量筒、量杯、烧杯、吸管、滴管、容量瓶、称量瓶、试剂瓶、玻璃缸、酒精灯等容量瓶、称量瓶、试剂瓶、玻璃缸、酒精灯等用于配制培养基、储藏母液、材料消毒等的各用于配制培养基、储藏母液、材料消毒等的各种化学实验玻璃器皿种化学实验玻璃器皿n n3. 器械类（１）镊子类（２）剪刀类（3）解剖刀（４）接种针（5）细菌过滤器 3.调控组织培养的主要环境条件         在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、PH值、渗透压等各种化学环境条件都回影响组织培养育苗的生长和发育 培 养 条 件—— 温度温度1 1、温度（、温度（、温度（、温度（temperature) temperature) 温温度度是是植植物物组组织织培培养养中中的的重重要要因因素素，，大大多多数数植植物物组组织织培培养养在在2323～～2727℃℃之之间间进进行行，，一一般般采采用用25±225±2℃℃。

低低于于1515℃℃时时培培养养，，植植物物组组织织会会表表现现生生长长停停止止，， 高于高于3535℃℃时对植物生长不利时对植物生长不利 但但是是，，不不同同植植物物培培养养的的适适温温不不同同月月季季的的最最适适温温度度是是2525～～2727℃℃、、番番茄茄是是2828℃℃温温度度不不仅仅影影响响植植物物组组织织培培养养育育苗苗的的生生长长速速度度，，也也影影响响其其分分化化增增殖殖以以及及器器官官建建成成等等发发育育进进程程如如烟烟草草芽芽的的形形成成以以2828℃℃为为最最好好，，在在1212℃℃以以下下，，3333℃℃以以上上形形成成率率皆皆最最低培 养 条 件—— 温度温度 不同培养目标采用的培养温度不同：n 百合鳞片在30℃以下再生的小鳞茎的发叶速度和百分率比在25 ℃以下的高n 桃胚在2～５℃条件进行一定时间的低温处理，有利于提高胚培养成活率n 用35℃处理草莓的茎尖分生组织3～５d，可得到无病毒苗培    养   条    件 2、光照（、光照（light））          组织培养中光照也是重要的条件之一，Ø                        光强   主要表现在     光质                           光照时间        培  养  条  件—— 光 照Ø1）光照强度（）光照强度（light intensity)            光光照照强强度度对对培培养养细细胞胞的的增增殖殖和和器器官官的的分分化化有有重重要要影影响响，，从从目目前前的的研研究究情情况况看看，，光光照照强强度度对对外外植植物物体体、、细胞的最初分裂有明显的影响。

细胞的最初分裂有明显的影响          光照强度：光照强度：1000lx——5000lx1000lx——5000lx• •黑暗条件：利于细胞、愈伤组织的诱导增殖黑暗条件：利于细胞、愈伤组织的诱导增殖• •光照条件：利于器官的分化光照条件：利于器官的分化 百合原球茎：黑暗下长出小球茎，关照下长出叶片百合原球茎：黑暗下长出小球茎，关照下长出叶片培  养  条  件—— 光光 照照Ø2）光质（）光质（light wave)              光光质质对对愈愈伤伤组组织织诱诱导导，，培培养养组组织织的的增增殖殖以以及及器器官官的的分分化化都都有有明明显显的的影影响响如如百百合合珠珠芽芽在在红红光光下下培培养养，，8 8周周后后，，分分化化出出愈愈伤伤组组织织但但在在蓝蓝光光下下培培养养，，十十几几周周后后才才出出现现愈愈伤伤组组织织，，而而唐唐菖菖蒲蒲子子球球块块接接种种1515天天后后，，在在蓝蓝光光下下培培养养首首先先出出现现芽芽，，形形成成的的幼幼苗苗生生长长旺盛，而白光下幼苗纤细旺盛，而白光下幼苗纤细        杨树：对愈伤组织生长红光促进蓝光阻碍杨树：对愈伤组织生长红光促进蓝光阻碍培    养    条    件ü3 3）光周期（）光周期（）光周期（）光周期（light period)  light period)    ü       试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，最常用的周期是组织培养，最常用的周期是16h16h的光照，的光照，8h8h的黑暗。

的黑暗ü                研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织，研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，如葡萄，茎切段培养在短日照下形成根如葡萄，茎切段培养在短日照下形成根 培 养 条 件 3、湿度（、湿度（humidity)             湿度的影响包括培养容器内湿度的保持和环境的湿度条件         1 1））   容容器器内内湿湿度度水水平平主主要要受受培培养养基基水水分分含含量量和和封封口口材材料料的的影影响响前前者者又又受受琼琼脂脂含含量量的的影影响响在在冬冬季季应应当当适适当当减减少少琼琼脂脂用用量量，，否否则则，，将将使使培培养养基基干干硬硬，，以以致致不不利利于于外外植植体体接接触触或或插插进进培培养养基基，，导导致致生生长长受受阻阻封封口口材材料料直直接接影影响响容容器器内内湿湿度度情情况况，，但但封封闭闭性性较较高高的的封封口口材材料料易易引引起起透透气气性性受受阻阻，，也也会会导导致致植植物物生长发育受影响。

生长发育受影响培 养 条 件n n        2        2））     环境的相对湿度可以影响培养基的水分环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发，一般要求蒸发，一般要求70%-80%70%-80%的相对湿度，常用加湿的相对湿度，常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度器或经常洒水的方法来调节湿度湿度过低会使湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进行湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污常进行湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污染染培   养   条   件 4、渗透压（、渗透压（penetrating pressure)            培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，而影响到渗透压的变化通常因此，而影响到渗透压的变化通常1-21-2个大气压个大气压对植物生长有促进作用，对植物生长有促进作用，2 2个大气压以上就对植物个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而生长有阻碍作用，而5-65-6个大气压植物生长就会完个大气压植物生长就会完全停止，全停止，6 6个大气压植物细胞就不能生存。

个大气压植物细胞就不能生存 培   养   条   件 5 5、、、、PHPH值值值值Ø        不同的植物对培养基最适PH值的要求也是不同的（见表），大多在5—6.5左右，一般培养基皆要求5.8，这基本能适应大多数植物培养的需要PH值适度因材料而异，也因培养基的组成而不同  培   养   条   件不同植物的最适不同植物的最适PH值值 种类种类种类种类 最适最适最适最适PHPH值值值值 种类种类种类种类 最适最适最适最适PHPH值值值值 杜鹃杜鹃 4.0 4.0 月季月季 5.8 5.8 越橘越橘 4.5 4.5 胡萝卜胡萝卜 6.0 6.0 石刁柏石刁柏 6.0 6.0 蚕豆蚕豆 5.5 5.5 桃桃 7.0 7.0 番茄、葡萄番茄、葡萄 5.7 5.7培  养  条  件Ø 以以硝硝硝硝态态态态氮氮氮氮作作氮氮源源比比以以铵铵铵铵态态态态氮氮氮氮作作氮氮源源PHPH值值较较小一些。

小一些Ø 一一般般来来说说PHPH值值高高于于6.56.5时时，，培培养养基基会会变变硬硬；；低低于于5 5时时，，琼琼脂脂不不能能很很好好地地凝凝固固因因为为高高温温灭灭菌菌会会降降低低PHPH值值（（约约0.2-0.30.2-0.3个个PHPH值值））因因此此在在配配制制时时常常提高提高PHPH值值0.2-0.30.2-0.3单位单位Ø PHPH值值大大小小调调节节可可用用0.1M0.1M的的NaOHNaOH和和0.1M0.1M的的HClHCl来来调调整整1ml1ml的的NaOHNaOH可可使使PHPH值值升升高高0.20.2单单位位，，1ml1ml的的HClHCl可可使使PHPH值值降降低低0.20.2单单位位调调节节时时一一定定要要充分搅拌均匀充分搅拌均匀 培      养       条      件 6 6、气、气、气、气 体（体（体（体（gas) gas) n n                氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。

通气考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥，最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起污染夏季易引起污染n n                固体培养基可加进活性炭来增加通气度，以利固体培养基可加进活性炭来增加通气度，以利于发根n n          培养室要经常换气，改善室内的通气状况培养室要经常换气，改善室内的通气状况n n          液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等同时要考虑容器的类型、培养基等   金花茶滤纸桥液体培养生根牡丹山茶在增殖蝴蝶兰试管苗开花情况非洲紫罗兰壮苗生根。