高中生物 5.3 血红蛋白的提取和分离课件 新人教版选修1.ppt

人教版选修1专题5 DNA和蛋白质技术课题3 血红蛋白的提取和分离一、基础知识： （一）蛋白质提取和分离原理 （二）蛋白质提取和分离的方法1、凝胶色谱法：又称分配色谱法2、电泳法 （三）缓冲溶液二、实验操作－－实验步骤血液组成成分 1.洗 涤 红 细 胞 2.释放血红蛋白 3.分离血红蛋白 4.透析血红蛋白样品处理 和粗分离纯 化纯度鉴定蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物理化学性质差异：1.分子的形状、大小2.电荷性质和多少3.溶解度 4.吸附性质5.对其他分子亲和力 1.凝胶色谱法 1）原理：2）材料：凝胶大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢凝胶是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖内 部有许多贯穿的通道.根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法概念：洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动混合物 上 柱洗 脱大分子流动快 小分子流动慢收 集 大分子收 集 小分子 2．凝胶电泳法：1）原理： 不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、 形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向 、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和 运动速度不同。

2）影响蛋白质分子运动速度的因素电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程思考：蛋白质为什么带有电荷？在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷影响蛋白质分子运动速度的因素决定 运动方向电场 作用力形成 阻力决定 运动速率电电荷性质质电电荷量分子形状分子大小√√√√√√√3）常用电泳方法琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质 －SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅 取决于分子大小 由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中 如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等缓冲溶液－－洗脱剂 1） 作用： 2）配制：调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定,从而 维持蛋白质空间结构思考：如何配制不同PH值不同的缓冲液？血液组成成分阅读思考： 1. 血液由______和________两部分组成 2. 血细胞中_______细胞数量最多，细胞的含量最 高的有机化合物是_____________ 3. 该化合物是由 _____________和____________构 成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2 结合的______________________基团。

血浆血细胞红细胞 血红蛋白 2条α-肽链2条β-肽链 亚铁血红素1.洗 涤 红 细 胞阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么 ？洗涤干净的标志是什么？血液 100mL3g柠檬酸钠低速离心 2 min红细胞血 浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min 重复洗涤3次，直至上清液没有黄色其他血细胞2.释放血红蛋白阅读思考： 1. 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了 哪些物质？ 2. 为了加速释放过程，采取了什么措施？目的分析： 1. 蒸馏水的作用是______________________________ 2. 加入甲苯的作用是____________________________ 3. 充分搅拌的目的是____________________________使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂为什么加入甲苯而不是其他的无机溶剂？滤纸过滤脂类物质3.分离血红蛋白 分离过程红细胞 混合液高速离心 10min 离心 管烧杯有机溶剂血红蛋白20mmol/L磷酸缓冲液4、透析血红蛋白透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除血红蛋 白中的小分 子杂质纯化方法－－本实验采用凝胶色谱法1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：3.样品的加入和洗脱步骤骤操作要求①②③④⑤立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液计算称量凝胶固定色谱柱材料：交联葡聚糖凝胶G-75 20mmol/L磷酸缓冲液 “G”表示什么？75代表什么？2、凝胶色谱柱的装填3、样品的加入和洗脱1.调液面2.加样3.再调液面4.洗脱 5.收集缓冲液凝胶注意事项注意事项 1、红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。

2、色谱柱的装填：装完后，立即用缓冲液洗涤、平衡凝胶使装填尽量紧密，降 低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流3、 凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡4、色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动否则容易使白细胞 、血小板、淋巴细胞等 其他血细胞同红细胞一 块儿沉淀，而无法将红 细胞分离！纯度鉴定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳判断纯化的蛋白质是否达到要求，需进行蛋 白质纯度鉴定，使用最多的是SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳知识总结血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原 理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组 成作 用蛋白质的提取分离样品处理粗 分 离纯 化纯度鉴定。