鸭副粘病毒分离鉴定、f基因序列分析及生物学特性研究.pdf

山东农业大学 硕士学位论文 鸭副粘病毒分离鉴定、F基因序列分析及生物学特性研究 姓名：纪巍 申请学位级别：硕士 专业：预防兽医学 指导教师：刁有祥 20090614 山东农业人学硕上学位论文 中文摘要 鸭副粘病毒病( D u c kP a r a m y x oV i r u sD i s e a s e ) 是由鸭副粘病毒( D u c k P a r a m y x oV l r u s ) 引起的一种病毒性急性传染病该病以气管环出血，肺 脏弥漫性出血，脾脏肿大为主要特征鸭副粘病毒属于副粘病毒科 ( P a r a m y x o v i r i d a e ) ，副粘病毒亚科，腮腺炎病毒属( R u b u l a v i r u s ) 长期 以来，禽l 型副粘病毒不感染水禽，水禽即使带毒也不发病但近年来， 该病的流行又呈现出新的特点；高抗体禽群发生该病，禽l 型副粘病毒对 水禽的致病力逐渐增强，水禽( 鹅、鸭、企鹅等) 不再仅是禽1 型副粘 病毒的宿主和储存库，已成为禽1 型副粘病毒的易感禽类其中鹅、鸭的 易感性最高，且不同同龄的鹅、鸭均易感，日龄越小，发病率和死亡率越 高，半个月内的雏鸭、雏鹅发病率和死亡率最高。

近年来，该病在我国呈 上升趋势，给我国养鸭业乃至整个养禽业带来巨大的经济损失 2 0 0 6 ．2 0 0 8 年在山东地区部分养鸭场出现鸭子大量死亡现象，本实验 室从来自潍坊、滨州、肥城、东营、泰安、济南的鸭病料和鸭胚中分离得 到六株鸭副粘病毒应用R T - P C R 技术对这六株副粘病毒的F 基因扩增 后进行序列测定，并与传统疫苗株、标准强毒株F 4 8 E 9 和已发表的2 4 株 鸭副粘病毒进行同源性比较、进化树分析，旨在从分子生物学水平阐明山 东地区鸭副粘病毒分离株之间的亲缘关系以及与其它地区流行株之间的 亲缘关系，为该病的预防和控制提供理论依据 本课题分二部分进行研究 第一部分：一株经鸭胚传递的鸭副粘病毒的分离鉴定及生物学特性研究 2 0 0 8 年6 月份山东省某种鸭场2 6 0 同龄的种鸭出现产蛋下降，但未出 现死亡，该种鸭群所产种蛋连续3 批在孵化至2 0 ～2 5 胚龄时出现约1 0 ％ 的死胚，出壳后雏鸭弱雏较多，部分雏鸭出壳后即出现神经症状，表现为 头颈扭转、角弓反张、斜颈、左右摇摆、站立不稳、瘫痪等，剖检可见脑 鸭副粘病毒分离鉴定、F 基因序列分析及生物学特性研究 膜出血、肺脏出血、十二指肠黏膜弥漫性出血。

为确定发病原因，我们对 死亡鸭胚、1 日龄的病死鸭及出现神经症状的雏鸭进行了病原的分离、鉴 定，确定为副粘病毒，命名为S D F C H 株，对该分离株的生物学特性进行 了研究毒力测定结果表明该病毒鸡肝平均致死亡时间( M D T ) 为5 6 ．6h ； 1 同龄S P F 鸡脑内接种分离病毒致病指数( I C P I ) 为1 ．7 8 ：6 周龄S P F 鸡 静脉接种致病指数( I V P I ) 为2 ．5 9 攻毒雏鸭生长缓慢，精神沉郁，剖检 可见气管弥漫性出血、肺脏出血、腺胃乳头出血、胰脏出血、十二指肠黏 膜弥漫性出血，个别雏鸭脑膜出旭 第二部分：鸭副粘病毒山东株F 基因克隆与序列分析 对2 0 0 6 - - 2 0 0 8 年从山东省不同地区规模化鸭场采集的疑似鸭副粘病 毒病症状的病料进行了鸭副粘病毒的分离鉴定及F 基因克隆和序列分析， 结果表明F 基因的核苷酸序列较稳定，不同地区6 株鸭副粘病毒毒株的F 基因全基因组序列均由1 6 6 2 b p 组成，彼此间核苷酸序列同源性达9 5 ．3 ％- - 一 9 9 ．8 ％，亲缘关系密切；与G e n b a n k 已发表的鸭副粘病毒参考毒株的同源 性介于8 7 ．4 ％- - - 9 7 ．8 ％；与G e n b a n k 已发表的鹅副粘病毒参考毒株的同源性 介于9 5 ．7 ～9 8 ．4 ％；与传统的疫苗株L a s o t a 株的同源性在8 7 ．7 ％～8 8 ．3 ％之 间；与F 4 8 E 9 的同源性在9 0 ．3 ‰9 1 ．0 ％之间。

系统进化树分析表明这6 株毒株与江苏、黑龙江、广东的鹅副粘病毒毒株和鸭副粘病毒毒株亲缘性 较近，属于同一分支本研究对所测定的6 株鸭副粘病毒毒株F 基因所对 应的氨基酸序列分析表明：6 株毒株之间的氨基酸同源性为9 5 ．3 ％～9 8 ．0 ％； 与G e n b a n k 已发表的鸭源副粘病毒的氨基酸同源性为8 7 ．4 0 ／0 ．．．9 7 ．5 ％；与鹅 源副粘病毒的氨基酸同源性为9 6 ．4 ％～9 8 ．4 ％：与传统的疫苗株L a s o t a 株的 氨基酸同源性为8 7 ．9 ％～8 8 ．3 ％；与F 4 8 E 9 的氨基酸同源性为9 0 ．1 ％- 9 1 ．O ％ 6 株毒株与鹅源副粘病毒的亲缘性较近，因此推测鸭副粘病毒是由鹅源副 粘病毒进化而来 2 山东农业大学硕士学位论文 B i o l o g i c a lI d e n t i f i c a t i o no f D u c kP a r a m y x o v i r u sA n d S e q u e n c i n go fF G e n eo fD u c kP a r a m y x o v i r u s P o s t g r a d u a t e ：J iw e i S u p e r v i s o r ：p r o ．D i a oy o u —x i a n g C o l l e g eo f A n i m a lS c i e n c ea n dV e t e r i n a r y M e d i c i n e ，S h a n d o n gA g r i c u l t u r eu n i v e r s i t y ，T a i a n 2 7 1 0 1 8 , c h i n a Ab s t r a c t D u c kP a r a m y x ov i r u sd i s e a s ei sr e g a r d e da so n eo ft h em o s td e v a e t a t i n g d i s e a s e so fp o u l t r yi nt h ew o r l d ，c a u s e db yD u c kP a r a m y x oV i r e s ．I ti s i n c l u d e da sa nO f f i c eI n t e r n a t i o n a ld e sE p i z o o t i e s ( O I E ) l i s tAd i s e a s e ．I nt h e p a s tt w od e c a d e s ，a ni n t e n s i v ev a c c i n a t i o np r o g r a ma g a i n s tD u c kP a r a m y x o v i r e sd i s e a s eh a db e e np r a c t i c e di nb o t hl a r g e —p o u l t r yo p e r a t i o n sa n dv i l l a g e p o u l t r yf a r m i n g ．T h i s d is e a s eb r e a k so u ti n f r e q u e n t l yi ns o m ev a c c i n a t e d f l o c k s ． S i xD u c kP a r a m y x oV i r u s e sw e r ei s o l a t e df r o ms h a n d o n gp r o v i n c e ．T h e F u s i o n ( F ) g e n e o ft h e s ei s o l a t e s t r a i n sw e r e a m p l i f i e db y r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( R T - P C R ) t e c h n i q u e ．T h eFg e n e sw e r e s e q u e n c e da f t e rt h ep r o d u c t so fa m p l i f i c a t i o nb e i n gc l o n e d ．S ot h a ti tc a ng i v e g r e a th e l pf o rt h es t u d yo f t h ep r e v a l e n c ea n dc o n t r 0 1 ． T h i ss t u d yi n c l u d e dt w op a r t s ． P a r t I ：B i o l o g i c a l I d e n t i f i c a t i o no f P a r a m y x o v i r u s I s o l a t e df r o m 鸭副粘病毒分离鉴定、F 基因序列分析及生物学特性研究 D u c k l i n g sa n dD u c k - e m b r y o s As t r a i nv i r u si s o l a t e df r o md u c k l i n ga n dd u c k —e m b r y o sw a si d e n t i f i e da s p a r a m y x o v i r u sb yH A ，H Ia n dn e u t r a l i z a t i o no fv i r u s ．T h ev i r u sw a sn a m e d S D F C Hs t r a i n ．T h eM D T ，I C P Ia n dI V P If o rS D F C Hs t r a i nw e r e5 6 ．6 h ，1 ．7 8 a n d2 ．5 9 ．L D 5 0o fd u c k ．e m b r y o si s10 ’85 ．T h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tS D F C H i s o l a t ew a sv i r u l e n t s t r a i n ．D u c k l i n g s a n d d u c k - e m b r y o s w h i c hw e r e c h a l l e n g e db yp a r a m y x o v i r u sS D F C Hs t r a i nh a dv i s i b l ep a t h o l o g i c a lc h a n g e ． T h ef u s i o n ( F ) g e n eo fS D F C Hs t r a i nw a sa m p l i f i e db yt h eR T - P C Ru s i n g t h r e ep a i r so fp r i m e r sd e s i g n e da c c o r d i n gt ot h ep u b l i s h e dg e n es e q u e n c e s ． T h eF g e n e o fS D F C Hs t r a i ne x h i b i t e d9 6 ．4 ％9 8 ．0 ％n u c l e o t i d ea n d 9。