植物组织培养综合实验报告--杜鹃花.doc

生物工程中游技术综合实验杜鹃花的组织培养探究并比较不同部位诱导愈伤组织的生长情况学院：生命科学学院专业：生物工程 摘要：实验选取杜鹃花的茎尖、茎段、叶片为外植体,;利用植物组织培养技术, 探究杜鹃花不同部位诱导愈伤组织的生长情况，并比较不同的植物生长素对杜鹃 花愈伤组织诱导分化影响的差异关键词：杜鹃组织培养愈伤组织1前言杜鹃花，杜鹃花科，杜鹃花属，为十大名花Z—, 乂称“花中西施”，别名 为：映山红、山石榴、山鹃等，属丁常叶或落叶灌木杜鹃花主要分布在欧洲、 亚洲和北美洲，但以亚洲最多，杜鹃花喜冷凉、湿润、通风良好的环境杜鹃花 的作用很多，其除了可作观赏用外，还有一定的经济价值，如有的叶花可入药或 提取芳香油，有的花可食用，高山杜鹃花根系发达，是很好的水土保持植物除 此Z外，杜鹃花还具有多种有用功能，如降压、利尿、阵病、镇咳，其还具有抗 菌、抗炎作用，还对心血管系统、痔疮有影响在2004年闫凤霞等探究杜鹃花的组培繁殖时发现，在相同培养基下，茎尖、 嫩叶诱导形成不定芽产生再生植株的效果较好；在2003年王荃的杜鹃花组织培 养技术研究中发现，愈伤组织的最适外植体是嫩叶，并研究了杜鹃花在不同培养 基条件下的生长情况。

通过研究者对杜鹃花组织培养的研究，杜鹃花已克服地域 限制，进入快速繁殖的阶段杜鹃花通常采用抒插、嫁接繁殖，但名贵品种难以生根，同样受季节、母株 材料等限制，不宜进行大量的商业化生产随着组培技术的发展，杜鹃花的试管 繁殖已成为可能，木本植物培养慕(WPM)和新的改良MS培养慕的研制，对培养杜 鹃花科植物非常有效，国内国外对杜鹃花的组织培养进行了研究，取得了一定进 展杜鹃花的组织培养一般取茎尖或带有侧芽的嫩茎作为外植体，这样可直接得 到大量的丛生芽，进而得到小植株国内外通过对杜鹃花组织培养近儿十年的研 究，已经初步建立了一套杜鹃组织培养的快繁体系，但是杜鹃花种和品种间的差 别、从生芽和不定芽分化率低、优良品种生根困难、完整植株的移栽体系等问题, 仍是杜鹃花组织培养中急需解决的问题2材料和方法2.1材料2.11外植体杜鹃花的茎尖、茎段、嫩叶2.1.2培养基配方一：MS+6・BA3+NAA().o5+3%蔗糖+8g琼脂(IL, pH=5.8)配方二：MS+6・BA|.5+NAA0.o5+3%蔗糖+8g琼脂(IL, pH=5.8)2丄3试剂蔗糖、琼脂、培养基母液(大量元素、微量元素、铁盐、有机附加物)2丄4仪器设备高压灭菌锅、分析天平、果酱瓶、烧杯、量筒、培养川L、灭菌的滤纸、称量纸、 玻璃棒、电炉、石棉网、移液瓶，剪刀，银子，解剖刀、酒精灯、记号笔、标签 纸、药匙等。

2.2方法2.2.1配制培养基2. 2.1.1计算：计算500mL培养基所需MS母液的吸取体积配制500mL培养基的母液用量母液名称3母液扩大倍数"500mL培养基吸取量(mL)&XAAAAr大量元素日20p25p ・微量元素"100仪5^ ・铁盐"100p5^ >有机附加物成分仪50^10p -PGRp浓度(mg/mL) a500mL培养基吸取量(mL)^vww6-BA20. D15p 卜Nd0. I*30. 25p2. 2.1.2移液与溶化：取50讥小烧杯一只，用移液管按照上表分别吸取各母液 装入该烧杯中取lOOmL烧杯，先用量筒量取100mL蒸帼水倒入烧杯中，用记号笔画好液位 线，再将一半蒸憾水倒岀将剩下的蒸傭水全都倒入电炉中，待水沸腾后，再把 称量好的琼脂、蔗糖、酵母提取物、活性炭依次加入，充分溶解后，再加入母液 混合液，用蒸憎水冲洗盛过母液的烧杯三次，一并倒入电炉中加热至沸腾后 将溶液倒入lOOmL烧杯中，冲洗电炉3次，加蒸憎水定容至设定的液位线2. 2.1. 3调节PH：用酸度计测定PH,用lmol/L HC1或lmol/L NaOH溶液将培养基PH调节至5. 82. 2.1. 4分装：将溶化的培养基趁热分装于杲酱瓶中，每瓶30mL,随即封口。

每 种培养基装3瓶果酱瓶用记号笔注明培养基代号、日期、第儿组2.2.2培养基及实验用具灭将分装好的培养基及其他用报纸包好的实验用具（剪刀、银子、解剖刀、装有滤纸的培养川L）及3瓶蒸谓水，置于121C高压灭菌锅中灭菌时间为15〜20mino2.2.3外植体的选择选取茎尖、茎段和嫩叶作为外植体2.2.4外植体表面消毒将杜鹃花的茎尖、茎段和嫩叶用洗衣粉清洗干净，在清水下冲洗15min,然 后在无菌条件下用75%酒精消毒15-30S,无菌水冲洗一次，再用0.1%HgCl2消毒 5-8 min,无菌水冲洗三次2.2.5接种在洒精灯上方，打开培养瓶口，把银子和瓶U在火焰上灼烧一会，待银子 稍冷却后，夹取消毒后的外植体放入瓶中，使其与培养基充分接触，培养瓶口还 要在酒精灯上灼烧一下，然后迅速盖上瓶盖226培养与观察把接种完毕的培养瓶放在25C的培养箱，光照培养每周一次生长情况和污染情况记录，并对比：A、 对比不同配方同种部位的生长情况B、 对比不同部位同种配方的生长情况3结果与分析3.1杜鹃花不同部位培养的污染情况3月27日在无菌实验室对杜鹃花不同部位进行接种培养，本次实验有两 种培养配方，每种配方接种不同部位的外植体6・7瓶，每瓶接种2・3个外植体。

其中污染率（％）=（污染的材料数/总接种材料数）X100诱导率（％）=（形成愈伤组织的材料数/总接种材料数）X100时间3实验材*斗3培养基配方9接种数a污染 数a污染率a主要污染菌种4第—周嫩叶9配方218心33细菌（白色）、真菌（黑 色菌丝）2配方II912a3p25%a茎段3配方2121256%a真菌（黑色菌幺幺）、细菌（白色）2配方II31如364曲茎尖3配方214a3亠21%a细菌（白色、黄色粘稠 菌斑）、真菌（白色菌丝”配方1215a23第二周Q嫩叶Q配方418卩3a17%^细菌（白色）、真菌（黑 色菌丝）3配方II912a评50%^茎段3配方218心12a67%a真菌（黑色菌幺幺）、细菌（白色）心配方II3如64%a茎尖a配方214p3亠2%细菌（白色、黄色粘稠配方II215a3菌斑）、真菌（白鱼菌丝"第八周a嫩叶4配方218心3a17%^细菌（白色）、真菌（黑配方II912a250%^色菌丝）卩茎段Q配方218a12]00曲真菌（黑色菌幺幺）、细菌配方II卩1如364%a（白鱼）亠茎尖3配方23亠2%细菌（白色、黄色粘稠 菌斑）、真菌（白色菌丝片配方II亠15a3a20%3表杜鹃花不同部位接种的污染情况,分析：从表一中可知，茎段的污染率较高，其次是嫩叶，茎尖的污染率相对 前而两种外植体较低，从实验数据知，污染的主耍微生物是细菌，主耍原因是在 接种时操作技术不规范造成的污染，原因可能是：①接种过程中，没有及时对接 种工具进行灭菌，应该每使用一段时间后沾乙醇灼烧一下灭菌;②接种时在讲话、 打喷嚏也会造成材料及培养基的污染；③在接种时，手臂从培养基、无菌材料、 无菌滤纸的上方经过，造成了污染；④在打开瓶盖时，没有灼烧一下瓶口，或者 接种结束后没有灼烧瓶口再盖瓶盖，使瓶口上沾有微生物；⑤在接种时远离酒精灯火焰，使得空气中的微生物进入瓶中或者污染外植体。

部分外植体被真菌污染 是因为材料本身是带菌的，在接种Z前没有对外植体清毒彻底有些外植体是后 期污染的，原因是手接触的瓶口，使得手中的微生物通过瓶口进入瓶中，造成材 料或者培养基的污染3.2杜鹃花不同部位在不同培养基下诱导愈伤组织的培养情况时间实验材 料培养基配方接种 数愈伤 组织 数愈伤组 织诱导 率实验现象第二周嫩叶配方I180010个发生褐变，其他无明 显变化配方II12004个发生褐变，其他尢明 显变化茎段配方I18004个12长出嫩叶，但4个 茎段发工褐变配方II14007个发生褐变，5个长出 嫩叶茎尖配方I14005个发生褐变，其他无明 显变化配方II15003个发生褐变，其他无明 显变化第四周嫩叶配方I180011个发生褐变，5个嫩叶 凸起配方II1218%8个发生褐变，一个嫩叶 长出浅绿色愈伤纽织茎段配方I18008个茎段发生褐变，3个 长出嫩叶配方II14006个茎段发生褐变，4个 长出嫩叶茎尖配方I14214%5个发生褐变，2个长出 浅黄色愈伤组织，7个长 出嫩叶配方II15004个发生褐变，5个长出 嫩叶第六周嫩叶配方I1816%12个发生褐变，1个长出 浅绿色的愈伤组织配方II12217%8个发生褐变，2个嫩叶 长出浅绿色愈伤组织茎段配方I1800部分茎段褐变死亡，部分 被污染配方II1400部分茎段褐变死亡，部分 被污染茎尖配方I14214%5个发生褐变，2个长出 浅黄色愈伤组织，5个长 出嫩叶配方II153204个发生褐变，5个长出 嫩叶,3个长出松散，呈浅黄色的愈伤纽•织，第八周嫩叶配方I18211%12个发生褐变，1个长出 浅绿色的愈伤纽•织，5个 凸起配方II12217%8个发生褐变，2个嫩叶 长出浅绿色愈伤组织萃段配方I1800部分茎段褐变死亡，部分 被污染配方II1400部分茎段褐变死亡，部分 被污染茎尖配方I14321%5个发生褐变，3个长出 浅黄色愈伤组织，7个长 出嫩叶配方II15640%,5个发生褐变，5个长出 嫩叶，6个长出浅黄色愈 伤组织，口松散实验原始图片如下:图2配方二茎尖前期的生长情况图1配方一茎尖前期的生长情况图3配方二嫩叶询期的生长情况图4配方一茎尖诱导愈伤组织的生长情况图6配方二萃尖诱导愈伤组织的生长情况图7配方二茎尖诱导愈伤组织的生长情况 图8配方一茎尖诱导愈伤纟I［织的生长情况分析：从表二中可以看出，两种配方的愈伤组织诱导率很低，并且大部分外植体 都褐变死亡了；原因可能是：在切割时，增大了其的伤口面积，并使伤口在空气 中暴露时间过长，或者培养的温度、pH造成了褐变。

从图1和图2中看到，茎 尖在培养的过程中长出了嫩叶，但是随着培养时间的增长，部分嫩叶发生了枯萎 现象，原因可能是所设计的培养基配方不适合嫩叶的生长情况；图3是嫩叶诱导 愈伤组织的前期现象，嫩叶凸起，但是在接种一开始的第一个星期，嫩叶大部分 发生了褐变，原因是嫩叶刚开始不适应在培养基中生长，但经过两个星期的适应 后，没有完全发生褐变的嫩叶返青，凸起，长出愈伤组织从图6中可以看出， 经过了八周的培养时间，配方二有利于诱导茎尖的愈伤组织，诱导时间较长，愈 。