农杆菌感受态细胞的制备与转化知识课件知识讲稿.ppt

实验五、农杆菌感受态细胞的制备与转化 实验目的：学习农杆菌感受态细胞的制备和转化原理实验要求：掌握农杆菌的特点及真核表达载体结构及应用 技术应用：高等植物（双子叶植物或单子叶植物）转 基因鉴定基因功能 ，包括过表达（诱导型或组成型），RNAi等 实验材料： 农杆菌GV3101菌株，重组双元表达载体pCAMBIA1300 试剂： YEB液体培养基（液体和固体），Kan（卡那霉素），Rif（利福平）； CaCl2(预冷)；NaCl；50%无菌甘油 实验原理： 1. 农杆菌简介： 第一例转基因植物就是用农杆菌介导法完成的 菌种：根癌农杆菌和发根农杆菌，二者均属革兰氏阴性菌，对双子叶植物侵染广泛，在某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性双元表达载体双元表达载体中Ti质粒pCAMBIA1300 的结构 挑取农杆菌GV3101单菌落接种于3ml 的新鲜YEB（无抗）液体培养基中，28 200r/mim振荡培养过夜； 按1：100的比例接种于50 ml YEB（利福平Rif 125 mg/L）的培养基中扩培，28继续培养至OD600=0.4-0.6将菌液置于冰上30min； 取1.4ml菌液，5,000 rpm，4离心5min，弃上清，将菌体悬浮于1.0 ml（预冷） 0.15 mol/L NaCl中。

5,000 rpm, 4离心5min，弃上清； 菌体用120l 预冷的20mmol/L CaCl2（4）轻轻悬浮细胞，之后加80l 50%无菌甘油，无菌甘油的终浓度为20%，液氮中速冻1 min，置-70保存备用或直接用于转化农杆菌感受态细胞的制备流程 将10l构建好的质粒DNA加入200 l 农杆菌感受态细胞中，混匀； 冰浴30min，液氮迅速冷冻3-5min，37水浴5 min； 加入1ml（无抗）YEB培养基，28振荡培养4h（选作）； 5000 rpm离心3min，弃去部分上清，重新悬浮细胞，涂布于YEB（Kan 100 mg/L 和Rif 125 mg/L）培养基上，28培养2-3d农杆菌转化。