wnt蛋白检测原理.ppt

Wnt蛋白检测原理一：概述• 1、WNT是一类广泛存在的分泌型糖蛋 白在动物的生长发育过程中，对细胞 的增殖、分化和迁移起巨大的调节作用 ，决定细胞的极性、命运、前体细胞的 增殖、体轴的建立，以及细胞的不对称 分裂等，在成人以后，则主要参与机体 内平衡稳定目前已知的主要有19种 WNT蛋白,其中激活经典通路的有WNT -1,WNT-3a和WNT-8 .• 2、在胚胎发育过程和中枢神经系统形成 中wnt信号通路具有重要的作用，调节着 细胞生长、迁移以及分化当体内的wnt 通路失活会导致一些肿瘤癌症的发生，如 果加入外源性的wnt蛋白可以激活wnt信 号通路 • 我们使用的是果蝇的的S2(果蝇胚胎细胞) 细胞，可以通过培养获得分泌的WNT3a 蛋白，因此需要检测wnt蛋白的活性一：检测用细胞L S/L细胞• L S/L细胞是小鼠的成纤维细胞这种 细胞里已经转入了TOPFlash 质粒载体 TOPFlash reporter 最早是由Hans Clevers实验室构建，上面包括转录因子 TCF/LEF 的结合位点，这个位点控制着 荧光素酶报告基因的表达，但受β- catenin 转录活性调控 。

1、 luciferase • L S/L细胞质中游离大量的β-catenin蛋白，易 与细胞内的降解复合体形成复合物，被蛋白酶 泛化，最后被降解 • 存在Wnt蛋白时，降解复合体活性受到抑制， 不与β-catenin结合， β-catenin不被降解，稳 定后的β-catenin 将进入细胞核，特异性地活 化转录因子TCF/L EF，激活Wnt 信号下游特 异靶基因的表达 (也就是荧光素酶的表达） • 所以荧光素酶的表达量跟wnt蛋白的量称正比TOPFLASHBuffer A&B（Galacton-plus），作为luciferase 的底物，发生下列生物荧光反应，产生有颜色的 物质，通过荧光扫描，读出OD值A2、β— galactosidase • L S/L细胞中除了转入了TOPFlash 质粒载体 ，还转入了LacZ基因，该基因是大肠杆菌乳 糖操纵子中的一个基因，能够翻译表达出β— galactosidase AcCeLeratorⅡ试剂作为β— galactosidase 的底物发生反应，产生有颜色 的物质，通过荧光扫描，读出OD值B • 所以β— galactosidase 的含量跟L S/L 的数 量成正比。

• 理论上每个孔的LS/L细胞的数量是50000 个但是实际上稀释加入时每空的细胞量有 不同，所以OD值A/B处理下来是单位细胞 对wnt蛋白的反映，再除以空白孔测定下来 的OD值C，得出比活，有利于每批wnt蛋白 含量高低的平行比较。