crispr-cas9细胞-动物koki实验基本流程-2.pdf

一、一、CRISPR-Cas9 细胞基因敲除敲入细胞基因敲除敲入实验基本实验基本操作操作流程流程 1)设计设计sgRNA ：： 1.1、确定待敲除基因的靶位点 根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找找到该基因CDS 区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分按照基因本身的性质，选择候选的待 敲除位点，确定待敲除位点对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将 基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子； 如果不能确定基因产物性质， 可选择将待敲除 位点放在起始密码子ATG后的外显子上如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码 成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列 1.2、 设计识别靶位点的一对DNA Oligos 确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到免费设计sgRNA的软件Input 框中（http://crispr.mit.edu/） ，然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列（网站设计一 般很慢或数据输出不完整，可使用我的内部软件，2天内输出全部结果，无物种限制） 。

一般 地，基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列（Protospacer AdjacentMotif）前间区序列邻 近基序，这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）的 20个nt而PAM序列的特征为NGG（其中N为任意核苷酸） 因此， sgRNA模板序列选择非 常方便，即使没有软件，研究者也可手工进行选择不过，软件可以给出该序列在基因 组中存在相似序列的情况，即可能的脱靶位点因此，利用软件可以选择脱靶机会小的 序列作为sgRNA模板序列根据选择的sgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNA Oligos （同时设计检测目的基因的引物一起合成） 1、http://crispr.mit.edu/ 2、http://www.broadinstitute.org/mpg/crispr_design/ 3、http://spot.colorado.edu/~slin/cas9.html 4、http://www.e-crisp.org/E-CRISP/ 5、http://flycrispr.molbio.wisc.edu/ 6、http://www.flyrnai.org/crispr/, Drosophila 7、 8、http://eendb.zfgenetics.org/casot/index.php 9、http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx 10、 根据酶切方式，选择合适接头，例如，PX458 等质粒 sgRNA 靶点 oligo 如下（Bbs1 酶切） 5‘-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 3‘- CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-CAAA-5‘ （1）对于 sgRNA 的长度，一般应为 20 nt 左右； （2）对于 sgRNA 序列的碱基组成，可选 3'末端含 GG 的 sgRNA，同时 sgRNA 种子序列尽 量避免以 4 个以上的 T 结尾，GC%含量最佳为 40%~60%； （3）sgRNA 的种子序列与脱靶位点的匹配数尽可能低 （4）如果构建 U6 或 T7 启动子驱动 sgRNA 的表达载体，需考虑 sgRNA 的 5' 碱基为 G 或 GG，以提高其转录效率； （5）对于 sgRNA 靶向基因的结合位置，如需造成基因移码突变，需尽量靠近基因编码区的 ATG 下游，最好位于第一或第二外显子； （6）检查 sgRNA 靶向结合位点基因组序列是否存在 SNPs； （7）如采用 Cas9 单切口酶，设计 paired-gRNA 需考虑成对 sgRNA 的间距； （8）全基因脱靶效应分析，需考虑脱靶位点最大允许几个错配碱基数，建议最少 5 个碱基。

重点考察种子序列和非种子序列碱基错配数， 以及脱靶位点是否位于基因编码区等， 另外还 可考察是否存在碱基插入或缺失的脱靶位点 特异性的 sgRNA 最好存在较少的脱靶位点， 不存在种子序列完全匹配的脱靶位点，不存在含有 1 和 2 个碱基错配的脱靶位点实验前， 首先应选择合适的软件进行 sgRNA 设计和全基因组脱靶效应评估，筛选 2~3 个活性可能高 且脱靶效率最低的 sgRNA再通过实验验证，依据实验结果选择最优的 sgRNA 2））构建构建 sgRNA 表达载体：表达载体： 将两条引物按照如下体系，退火后连接进 sgRNA 表达载体中， 转化 DH5a、Stbl3 细菌，挑取单克隆测序鉴定 Annealing and cloning procedure: 1. Anneal each pair of oligos: 1 µl oligo 1 (100 μM) 1 µl oligo 2 (100 μM) 8 µl H2O 10 µl total Anneal in a thermocycler at 95℃ 5 min and then leave on the bench at RT to cool down for 1hr. Dilute the annealed oligo 1:250 (250 - fold). 2. Set up digestion reaction: （pX330/pX335 载体和内切酶 BbsI 为演示案例） X µl pX330/pX335 or other backbone vector (at least 2 µg) 2 µl 10X NEBuffer 2.1 1 µl BbsI (NEB) Use more if cutting more DNA H2O to final Volume of 20 µl Incubate the digestion reaction at 37oC for at least 4hr. Run ~200ng on agarose gel to ensure COMPLETE digestion. When digest is complete, heat inactivate (65°C for 20 min) or column purify linearized plasmid. 3. Set up ligation reaction: X µl pX330/pX335 BbsI digested vector (100ng) 2 µl annealed oligo duplex from step 1 (1:250 dilution) 2 µl 10x DNA ligase buffer (make sure fresh, else ATP or DTT may be shot) 1 µl T4 ligase Y µl H2O to 20 µl final volume - Incubate the ligation reaction according to manufacturer recommendations. 4. Transformation with 1 - 2 ul of the final product into competent cells. 5. Pick colony and sequence verify with U6 sequencing primer (U6seqF: ACTATCATATGCTTACCGTAAC) 3））质粒质粒制备制备：：用去内毒素试剂盒抽提质粒，测定浓度，琼脂糖电泳检测质粒质 量。

sgRNA 表达质粒 Cas9 表达质粒（或二合一质粒） 4）培养细胞和转染）培养细胞和转染 a）准备培养皿，培养细胞，细胞汇合度 70%左右时进行转染 b）按照 Lipofectamine® 2000（或 DfectorTM 原代细胞转染试剂）转染说明书转 染细胞，如果是分开表达的质粒（质粒质量比 1:1） c）转染 48h 或 72h 后提取细胞基因组 DNA，提前设计好检测 on-target 或预测的 off-target 引物，PCR 扩增目的片段 （引物在切口两端不对称设计，100:200 或 者 200:300bp） 5））T7E1 酶切酶切法检测突变体法检测突变体 T7 核酸内切酶 I 是一种具有底物结构选择性的酶 该酶以不同的活性作用于不 同的 DNA底物 切割特定底物时， 必须控制酶量和反应时间 反应温度超过42℃ 时，会增加非特异性核酸酶活性避免反应温度超过55℃，会导致酶活性降低 a) PCR扩增出带有突变位点(CRISPR/Cas9的target site)DNA片段，长度约500bp， 突变位点最好不位于PCR片段中央，这样将切割出两条大小不同的带 b)突变体 DNA 与野生型 DNA 的 PCR 产物按如下体系进行混合， 进行加热变性、 退火复性处理。

（如果测混合克隆，直接将 PCR 产物变性，退火复性处理） 表 1. T7E1 酶切体系和反应条件 c)上述反应体系分别加入 0.5ul T7E1 酶，37℃反应 30 min 后，跑 2%的琼脂糖凝 胶电泳检测分析酶切结果 图 2-1. T7E1 酶切法检测图 图 2-2. T7E1 酶切法检测图 6））测序评估：测序评估：将 PCR 产物连接进 T 载体中， 转化进 DH5a 细菌， 随机挑取 15-20 个单菌落进行测序，评估目标片段被切割后碱基变化和切割效率 图 3. 单克隆测序 7））PAGE 胶检测突变体：胶检测突变体：制备非变性 PAGE 胶，检测 PCR 产物，检测 on-target 或预测的 off-target sites 位点 (可选方法) 图 4. PAGE 胶检测突变体模式图（REF. SCIENTIFIC REPORTS,2014） 8）） 稀释法筛单克隆 先从 A1 孔（细胞原液约 1000 个细胞/孔，数量根据细胞状态调整）至 H1 孔方 向对半稀释，然后第一列再横向对半稀释，显微镜观察含单细胞的孔 9）设计）设计 ssODN 寡核苷酸寡核苷酸（（KI）） Designing an ssODN template for HR-mediated repair 5’ — (~60 - nt 5’ homology) NNN NGG (~60 - nt 3' homology) — 3’ 如果用 donor 质粒，同源臂理论上越长越好，比如 KI 1K 左右的基因，同源臂设 计在 1K bp 左右。

二、利用二、利用CRISPR系统系统建立建立基因敲除动物品系基因敲除动物品系实验过程：实验过程： 2.1 确定待敲除基因的靶位点 2.2 设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligo（引物） 2.3 构建可表达sgRNA的Cas9质粒 2.4 体外转录sgRNA 和Cas9 RNA 2.5 将sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵检测sgRNA活性 2.6 将有活性的sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵建立Founder 2.7 将Founder自交得到F1 2.8 F1自交得到F2 2.1 确定待敲除基因的靶位点 同前 2.2 设计识别靶位点的一对DNA Oligo（引物） 同前 2.3 构建可表达sgRNA的Cas9质粒 同前，选择带有T7启动子的质粒 2.4 体外转录sgRNA 和Cas9 RNA 使用特定引物，以上述质粒为模板，以高保值酶分别对Cas9和sgRNA 进行PCR扩增，循环数设为30个，20 ul反应体系然后将产物纯化用 作体外转录模板 体外转录时，C。