梯度离心.ppt

黑龙江生物科技职业学院,生物制药技术,生物分离技术,主讲人：张爱华,实训四 DNA制备,,实验原理,2,,材料用具,3,,操作方法,4,目的要求,,2,1,5,5,注意事项,目的要求,了解密度梯度离心分离原理，了解DNA粗提方法掌握密度梯度离心制作过程及方法原理,在较大的离心力作用下，不同的DNA 由于其大小、形状 和密度不同，而悬浮在不同密度的位置上，从而达到分离核酸分子中的碱基含有共轭双键，具有一定的紫外吸收特 性，其最大吸收峰的波长为260nm在波长为260nm，光程 为1cm，A260＝1时，相当于双链DNA浓度为50μg/mL，单 链DNA为40μg/mL紫外分光光度法可用于测定浓度大于 0.25μg/mL的核酸浓度 DNA浓度计算公式：C（μg/mL）＝40μg/mL×1/光程×A260 ×稀释倍数材料用具,新鲜的鸡肝,生理盐水（冷）、5%十二烷基磺酸钠溶液、45%乙醇、95%乙醇（冷）、 乙醇（冷）、丙酮（冷）、氯化钠粉末、5%、10%、20%、30%蔗糖溶 液（5%蔗糖溶液配制：称取蔗糖5g溶于100mL 蒸馏水液中，加5g活性 炭，于沸水浴中加热25min，过滤取清液）,离心机、灭菌离心管（10mL）、烧杯（1L）、大三角瓶、天平、量 筒、匀浆机、1.0mL注射器、超速离心机、No.22针头、紫外分光光 度计等。

蔗糖 密度 梯度 溶液 的制 备,将5%、10%、20%、30%蔗糖溶液各10mL，按浓度依次减小的顺序逐个铺入离心管中即制成不连续阶梯密度梯度此离心管于20-25℃静置2--3h，通过重力作用即成接近线性的连续密度梯度液若用细铁丝轻敲离心管，静置时间可以缩短至0.5～1h温度低时所需静置时间较长，温度高时则较短为减少对流，静置后应将离心管置冰浴中备用DNA 样品 制备,（1）组织破碎：取一定量的新鲜的鸡肝，加4倍量生理盐水，经组织捣碎机捣碎l min，匀浆，2500r/min离心30min,沉淀用同样体积生理盐水洗涤3次，每次洗涤后离心，将沉淀物悬浮于20倍量的冷生理盐水中，再捣碎3min （2）除杂蛋白：上述组织液中加入2倍量5％的十二烷基磺酸钠，用45％乙醇作溶剂，搅拌20～30min,在0℃，2500r/min离心，收集上清液并加入等体积的冷95％乙醇，离心即可得到纤维状DNADNA 样品 制备,（3）精制：将粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5％的十二烷基磺酸钠，用1/10体积45％乙醇作溶剂，搅拌0.5h,经5000r/min离心15min，上清液中加入NaCl至终浓度1 mol/ L，再缓慢加入冷95％乙醇，DNA析出。

（4）样品制备：取上述DNA溶于适量蒸馏水中，用紫外分光光度计测其含量梯 度 离 心,（1）在每个离心管内的梯度溶液表面，分别加入1.0mL DNA样品溶液加样时，用注射器吸入样品，在梯度溶液表面上方0.5mm左右，沿管壁慢慢加入不允许自由滴落，也不允许针头接触梯度液面 （2）装好样品后，小心拧紧离心管帽，装好套筒、转头，按使用程序启动超速离心机，在0℃以25000r/min离心分离1～3h梯度 溶液 的分 部收 集,离心后，取出离心管，置于冷室中用No.22针头将聚乙烯离心管底部正中位置穿刺，梯度溶液慢慢流出用小试管将流出的梯度溶液分部收集，每管25滴DNA 浓度 测定,用适量双蒸水稀释收集的样品，用紫外分光光度计测定各管DNA样品的A260，根据公式计算DNA浓度 C（μg/mL）＝40μg/mL×1/光程×A260 ×稀释倍数注意事项,1、注意操作温度2、组织捣碎机捣碎的时间不可过长思考 题,为什么所用离心管等器皿必须灭菌？ 蔗糖密度梯度在离心中起什么作用？,。