抗肿瘤肝微粒体代谢种属比较研究报告.doc

抗肿瘤肝微粒体代谢种属比较研究报告目录1 5肢關 32材料与方法 32.1药品 32.2样兄及预处理方法 32.3仪器和条件 32.4数据分析 43结果 43.1抗肿瘤对照品溶液的UPLC-UV/Q-TOFMS分析 43.2 UPLC-UV/Q-TOFMS法鉴定肝微粒体孵育液中的抗肿瘤相关代谢产物 43.2.1 MO ([M+H]\ m!z 809.265) 53.2.2 Ml ([M+H]+，m/z 212.101) 53.2.3 M2 ([M+H]+, m/z 364.129) 53.2.4 M3 (|M+H广，m/z 380.125) 53.2.5 M4 ([M+H]+, m/z 464.147) 63.2.6 M5 ([M+H]+，m/z 480.142) 63.2.7 M6 ([M+H]+，m/z 709.210) 63.2.8 M7 ([M+H]+, m/z 825.259) 6O吉 i仑 7醐 8瞧 231研究目的本研宂比较抗肿瘤在人、猴、犬、大鼠和小鼠五个种属肝微粒体中代谢过程的差 异，为临床前药动学和安全性评价研究动物种属的选择提供参考2材料与方法 2.1药品抗肿瘤储备液由美辿四普亚医药科技（上海）有限公司提供。

2.2样品及预处理方法肝微粒体样品由美迪西普亚医药科技（上海）冇限公司提供取肝微粒体双样本 样品各60|iL合并，获得人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒体的0 min和60 min样品 加入360 |iL乙腈沉淀蛋白，离心10 min （4000 rpm）全取上清液于40 （）C空气下吹 干，残留物用120 |IL乙腈/水（1:9, v/v）溶解，涡流混合取2.0 pL进行 UPLC-UV/Q-TOF MS 分析2.3仪器和条件仪器美国Waters公司Synapt G2-Si型四极杆•飞行时间串联质谱仪（Q-TOF MS）,配有电喷雾电离源（ESI源）和AcquityUPLCH-CLASS液和色谱系统色谱条件色谱柱为 ACQUITYUPLCHSST3C18coIumn （2.1 X 100 mml.D., 1.7 gm粒径），美国Waters公司；柱温为45C;流速为0.4 mL/min;紫外检测波长200 -600 nm，流动相梯度见下表时间 （min）A （水含0.1%甲酸）B （乙腈含0.1%甲酸）0.09551.59558.525759.559512.0955质谱条件离子源为电喷雾电离源（ESI）,正离子扫描方式检测，去溶剂气（氮 气）流速为750L/h,去溶剂气温度为350 （）C,源温度为120 C,毛细管电压为3.0 kV。

低能量扫描吋传输碰摘能量为2 eV,阱碰摘能量为2 eV;高能量扫描吋传输碰撞能量为12 - 18 eV,阱碰撩能量为18 - 32eV扫描范围为m/z50 - 1200选取400 ng/mL的亮氨酸-脑啡肽（m/z 556.2771）作为质荷比校正外标物，流速 为 6 pL/mino2.4数据分析采用Waters公司的Masslynx V4.1软件进行数据采集，采用Waters公司的 Masslynx V4.1中的子软件MetaboLynx XS进行数据分析3结果3.1抗肿瘤对照品溶液的UPLC-UV/Q-TOF MS分析首先对抗肿瘤对照品溶液进行UPLC-UV/Q-TOF MS分析，推测质谱裂解规律， 为其他代谢产物结构推测奠定基础在本研究选取的色谱条件下，抗肿瘤的色谱保留时间为7.74 min （阁1A和1B）, 一级全扫描质谱图中（图1C）,获得m/z 809.265的准分子离子（[M + H]+）在高碰撞 能量下，产生 m/z 112.048、272.046、387.069、524.093、661.117 和 735.192 的碎片离 子为了便于描述，将抗肿瘤结构中的两个羧酸酯键分别命名为酯键A和酯键B。

推 测的抗肿瘤的质谱裂解途径如图2所示本试验将根据这些质谱断裂特点，鉴定抗肿 瘤在肝微粒体中的代谢产物（阁3和4）代谢物按照分子量和保留吋间依次命名3.2 UPLC-UV/Q-TOF MS法鉴定肝微粒体孵育液中的抗肿瘤相关代谢产物与孵育0 min的肝微粒体比较，在孵育60 min肝微粒体样品中主要发现8种相关 离子，其质荷比分別为 m/z 809.265、212.101、364.129、380.125、464.147、480.142、 709.210 和 825.259,分别命名为 MO、Ml、M2、M3、M4、M5、M6 和 M7其中 M3检测到两个色谱峰，根据保留时间分别命名为M3-1和M3-2； M7检测到三个色 谱峰，根据保留时间分别命名为M7-1、M7-2和M7-3在人肝微粒体孵育体系中检测 到所冇代谢物MO、Ml、M2、M3、M4、M5、M6和M7 （图3A）在猴肝微粒体孵 育体系中检测到Ml、M2、M3-1、M4、M5和M7-2 （图3B）在犬肝微粒体孵育体 系中检测到MO、Ml、M2、M3-1、M4、M5、M6和M7-2 （图3C）在大鼠肝微粒 体孵冇体系中检测到代谢物Ml、M2、M3-1和M4 （阁3D）。

在小鼠肝微粒体孵冇体 系中检测到代谢产物Ml、M2、M3-1、M4和M5 （图3E）这些离子的精确质量信息以及可能元素组成见表1为了确定这些相关离子对应的 结构，对这些离子进行产物离子全扫描质谱分析3.2.1 MO ([M+H]\ m/z 809.265)在人和犬肝微粒体中能检测到M0,以人肝微粒体样品为例对MO的鉴定加以说 明从人肝微粒体MDF色谱图中选择性检测m/z 809.265,在保留时间tR为7.75 min 出现一个色谱峰（阁5-1）,命名为MOM0与抗肿瘤对照品溶液的色谱保留时间以及 质谱行为相同，确定M0是未被代谢的原形药物抗肿瘤3.2.2 Ml （[M+H]+, m/z 212.101）在人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒体中均能检测到Ml,以人肝微粒体样品为例 对Ml的鉴定加以说明从人肝微粒体MDF色谱图中选择性检测m/z 212.101,在保 留时间化为5.37 min出现一个色谱峰（阁5-2）,命名为Ml根据精确质量，推测 Ml的分子式为C9H13N3O3,比原形减少C23H27N3O11F4在高碰撞能量下，Ml 产生与原形相同的碎片离子m/z 112.051碎片离子m/z 156.041为末端丁基断裂后产 生，因而推测Ml为原形7V-去烷基化的代谢产物。

3.2.3 M2 （[M+H]+，m/z364.129）在人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒体中均能检测到M2,以人肝微粒体样品为例 对M2的鉴定加以说明从人肝微粒体MDF色谱图中选择性检测m/z 364.129,在保 留吋间什为5.86 min出现一个色谱峰（图5-3）,命名为M2根据精确质量，推测 M2的分子式为C14H19F2N3O6,比原形减少C18H21N3O8F2在高碰撞能量下，M2 产生与原形相同的碎片离子m/z 112.051碎片离子m/z 308.069为末端丁基断裂后产 生因而推测M2为原形酯键A水解的代谢产物3.2.4 M3 （[M+H]+, m/z 380.125）从人肝微粒体MDF色谱图中选择性检测m/z 380.125,在保留吋间以为4.38和 4.62 min各出现一个色谱峰（图5-4）,分別命名为M3-1和M3-2在人、猴、犬、大 鼠和小鼠肝微粒体中能检测到M3-1，而M3-2仅在人肝微粒中检测到以人肝微粒体 样品为例对M3的鉴定加以说明根据精确质量，推测M3的分子式为C14H19F2N3O7 ,比原形减少C18H21N3O7F2在高碰撩能量下，M3-1和M3-2产生相似的碎片离子。

碎片离子 m/z 156.041和308.069与M2的碎片离子相同碎片离子m/z 228.098比M2的碎片离 子m/z 212.104增加了 16 Da,因而推测M3为M2羟基化的代谢物3.2.5 M4 ([M+H1+, m/z 464.147)在人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒体中均能检测到M4从人肝微粒体MDF色谱 图中选择性检测m/z 464.147,在保留时间“为6.37 min出现一个色谱峰(图5-5),命 名为M4根据精确质量，推测M4的分子式为C18H23F2N3O9,比原形减少 C14H17N3O5F2在高碰撞能量下，M4产生原形相冋的碎片离子m/z 112.051 o碎片 离子m/z 156.041和212.103与M2的碎片离子相同因而推测M4为原形酯键B水解 的代谢产物3.2.6 M5 ([M+H]+, m/z 480.142)在人、猴、犬和小鼠肝微粒体中均能检测到M5以人肝微粒体样品为例对M5的 鉴定加以说明从人肝微粒体MDF色谱图中选择性检测m/z 480.142,在保留时间tR 为4.99 min岀现一个色谱峰(图5-6),命名为M5根据精确质量，推测M5的分子 式为C18H23F2N3O10,比原形减少C14H17N3O4F2。

在高碰撞能量下，M5产生与原 形相同的碎片离子m/z 272.046碎片离子m/z 390.075比M4的碎片离子m/z 364.096 増加丫 16 Da因而推测M5为M4羟棊化的代谢产物3.2.7 M6 ([M+H]+, m/z 709.210)仅在人和犬肝微粒中能检测到M6以人肝微粒体样品为例对M6的鉴定加以说 明从人肝微粒体MDF色谱图中选择性检测m/z 709.210，在保留时间tR为6.00 min 出现一个色谱峰(图5-7)，分别命名为M6根据精确质量，推测M6的分子式为 C27H32F4N6O12,比原形减少C5H8O2在高碰撞能量下，M6产生与原形相同的碎 片离子m/z 112.050、272.048、387.071和524.093,因而推测M6为原形酰胺水解的代 谢产物3.2.8 M7 ([M+H]\ m/z 825.259)从人肝微粒体MDF色谱阁中选择性检测m/z 825.259,在保留时间tR为6.63、6.69 和6.88 min各出现一个色谱峰(图5-8),分别命名为M7-1、M7-2和M7-3M7-1和M7-3仅在人肝微粒中能检测到，而M7-2可在人、猴和犬肝微粒中被检测到。

根据精确质量，推测M7的分子式为C32H40F4N6O15,比原形增加一个O在高碰撞能量下，M7-1〜M7-3生成相似的二级图谱，均产生与原形相同的碎片离子m/z 272.047、387.081、524.095、661.118 和 735.189碎片离子 751.176 比原形的碎片 离子m/z 735.189增加16 Da,因而推测M7-1〜M7-3均为原形羟基化的代谢产物4结论抗肿瘤在人肝微粒体中孵化60 min后，仅检测到少量原形药物，共检测到10 种代谢产物从LC-MS和UV峰面积判断，主要的代谢途径为酯键A水解（M2）, 其次为酯键B水解（M4）在猴肝微粒体中孵化60 min后未检测到原形药物，共检测 到6种代谢产物，主要的代谢途径为酯键A水解在犬肝微粒体中孵化60 min后仅 检测到少量原形药物，共检测到7种代谢产物，主要的代谢途径为酯键A水解，其次 为酯键B水解在大鼠和小鼠肝微粒体代谢较为相似，孵化60 min后均未检测到原 形药物，分别检测到4和5种代谢产物，主要代谢途径均为酯键A水解另外，在大 鼠和小鼠肝微粒孵育0 min的对照样品中也可以检测到酯键A的代谢产物M2和酯键 B水解的代谢产物M4 。