考马斯亮蓝法测定蛋白浓度.docx

考马斯亮蓝法肾组织总蛋白定量一、 实验原理考马斯亮蓝G250比色法，也被称为Bradford法是常用的一种蛋白质浓度的测定方法考马斯亮蓝G250 是一种染料，能与蛋白质通过疏水作用结合，形成蛋白质-染料复合物，颜色由红色转变为蓝色，最大光吸 收波长为595nm，并且在低浓度范围（0.01〜1.0mg/mL）内，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律二、 实验材料1、 实验设备 电子天平、分光光度计、恒温水浴锅2、 试剂 考马斯亮蓝储备液（蒸馏水1： 4稀释，现配）、蛋白标准品、NaCl三、 操作步骤（一） 样品前处理组织：肾组织1. 准确称量肾组织0.1g，按质量和体积比加生理盐水制备成10%组织匀浆（注意使用匀浆混匀器时未避免 摩擦产生热量会隔10秒钟暂停一下），2. 将匀浆吸入1.5毫升的离心管中，将离心管进行标号3000r/min,离心10min后3. 取组织匀浆上清，再用生理盐水按1:9稀释取样本10微升，生理盐水90微升稀释成1： 9的组织匀浆 混匀三管混匀静置10min于测定波长595nm处的吸光值二） 标准曲线的制作1. 用空白管取生理盐水50U1，考马斯亮兰3ml；标准品管取标准品50U1，考马斯亮兰3ml；测定管取样本 50U1，考马斯亮兰3ml。

分别对管子进行标注2. 三管混匀后静置10min，将分光光度计的波长调整为595nm，预热20min.3. 打开样品槽盖分别将空白管、标准品管、测定管放入样品槽中比色皿取毛面将分光光度计的模式调至 特射比开盖调0，关盖调满，拉杆调吸光度记录数据三） 目标样品的蛋白浓度测定1.计算公式:蛋白的含量二测定管的OD值-空白管的OD值/标准管的OD值-空白管的OD值x标准液的浓度（蛋 白含量）四、 注意事项1、稀释度2、样本的蛋白浓度必须稀释到1.3g/l 一下，在此范围才会呈线性关系五. 实验结果：实验未能达到预期的一条直线可能原因：1.样本放置太久，蛋白质变性实验比色皿未清洗，导致比色误差，人为操作不当六. 讨论分析：此方法优点：1.灵敏度高2.测定快速简便3.干扰物质少缺点：1 .用于不同蛋白质测定有较大的偏差2.任然有一些物质干扰此法的测定3.只能用标准曲线测定蛋白 的浓度。